초록 ▼

1. 에너지 대체를 위한 질소고정균의 육종 가. 전국 밭토양에서 Rhizobium균을 수집 분리하고, 질소 고정 활성을 측정하여 우수균주를 선발한다. 나. 선발된 우수 Rhizobium균의 plasmid를 분리 확인, molecular weight 를 결정하고 nif 및 nod 유전자의 존재여부를 확인함과 동시에 gene mapping을 위한 기초조사를 실시한다. 다. Rhizobium의 각종 유전자의 cloning system을 개발한다. 라. 우수 Rhizobium의 분자 육종을 위한 기본기술로 nif, nod 유전자의 tra

1. 에너지 대체를 위한 질소고정균의 육종 가. 전국 밭토양에서 Rhizobium균을 수집 분리하고, 질소 고정 활성을 측정하여 우수균주를 선발한다. 나. 선발된 우수 Rhizobium균의 plasmid를 분리 확인, molecular weight 를 결정하고 nif 및 nod 유전자의 존재여부를 확인함과 동시에 gene mapping을 위한 기초조사를 실시한다. 다. Rhizobium의 각종 유전자의 cloning system을 개발한다. 라. 우수 Rhizobium의 분자 육종을 위한 기본기술로 nif, nod 유전자의 transfer에 이용되는 conjugation 및 transformation의 빈도를 향상시키기 위하여 spheroplast 형성조건을 확립한다. 마. Transposon Tn 5를 이용한 conjugation 최적조건을 확립하고 Tn 5가 삽입된 Rhizobium의 mutant bank를 얻는다. 바. Nif 및 nod structural gene을 probe로 한 후 nick translation technique을 이용하여 선발된 Rhizobium 균주의 total DNA와의 hybridization을 실시, nif, nod 유전자의 존재를 확인한다. 사. 대두접종제 개발을 위하여 선발된 우수균주의 접종효과를 실내 및 포장 예비실험으로 확인한다. 아. 우수 Rhizobium균과 대두장려품종과의 친화성 관계를 검토 조사한다. 자. 수도작 관련 질소고정균을 분리한 후 질소고정활성을 측정하여 우수균주를 선발한다. 차. 질소고정관련 유전자를 식물세포로 이식할 수 있는 vector로 사용할 Agrobacterium sp. 의 분리 및 함유 Ti-plasmid를 확인한다.2. 에너지 생산을 위한 섬유소 분해균 및 알콜 생산균의 육종 가. 섬유소 분해능의 검출방법을 개발하기 위하여 섬유소 분해능을 가진 균만이 자랄 수 있는 선택배지를 개발한다. 이 배지와 기존의 congo red 염색법을 병용하면 섬유소분해능의 유무를 판별할 수 있을 뿐아니라 효소의 세포내외성을 구별할 수도 있다. 나. 유전자공여균의 선택을 위하여 여러가지 기초 조사를 한끝에 다음 3가지 균에서 섬유소 분해 유전자를 따 오기로 결정하였다. Bacillus stearothermophilus, B. subtilis 및 Cellulomonas fimi의 3종류이다. 다. 섬유소 분해 유전자의 분리 1) B. stearothermophilus의 염색체 DNA에서, 섬유소 분해 유전자를 따서 pBR 322 DNA에 붙여,섬유소 분해 유전자를 가진 잡종 plasmid를 만든다. 2) B. subtilis의 염색체 DNA에서 섬유소 분해 유전자를 따서 pBR 325위에 붙여, 새로운 잡종 plasmid를 만든다. 3) C.fimi의 염색체 DNA에서 섬유소 분해 유전자를 따서 pBR 322 DNA에 붙여섬유소분해 유전자를 가진 새로운 잡종 plasmid를 만든다. 라. 유전자 지도의 작성 위의 연구에서 만들어진 섬유소 유전자를 포함한 새로운 잡종 plasmid들에 대한 분자적인 성질을 규명한다. 즉, plasmid의 전체의 크기, 각종 제한 효소들의 작용부위의 결정 및 섬유소 분해 유전자 부분의 위치, 전사 방향, 크기등을 조사하여 유전자 지도를 작성한다.

Abstract ▼

1 . The development of nitrogen fixing bacteria for energy saving. 1) 1-4 plasmids of 35-300Md were tested each, in almost R. japonicum which were selected from the various domestic field and observed to be excellent in nitrogen fixing activity. 2) For nod gene mapping, plasmid cured cells of R. jap

1 . The development of nitrogen fixing bacteria for energy saving. 1) 1-4 plasmids of 35-300Md were tested each, in almost R. japonicum which were selected from the various domestic field and observed to be excellent in nitrogen fixing activity. 2) For nod gene mapping, plasmid cured cells of R. japonicum were obtained from acridine orange, ethidium bromide, SDS or heat treatment, and now their genetic relationship with nod gene are being characterized. 3) For the transfer of nif and nod genes between species spheroplasting condition of fast growing R.japonicum was optimized through changing the amount of glycine and lysozyme and incubation time, resulting in formation above 95% spheroplast of R.japonicum. In addition, morphological change during spheroplasting was also observed. 4) Mutagenesis using transposon Tn5 through conjugation was conducted to make mutant bank in nif and nod gene of R.japonicum transfer frequency was low of $10^{-5}/;-/;10^{-7}$ but was thought that it could be improved to the level of $10^{-3}/;-/;10^{-4}$. 5) Total chromosome hybridization of R. japonicum with nif structural and nod gene probe showed sequence homology of 4 bands in USDA 191, 2bands in R247, R27l, each from nif gene but more bands in all 3 strains from nod gene. However, R-247, R-271 showed less intense sequence homology than did USDA 191. 6) In the field test of 6 excellent soybean inoculants isolated in this lab., the mean yield of inoculated group (237.0 Kg/10a) was increased by 6-10% comparing to the mean yield of uninoculated group (219.8kg/10a) 7) In the affinity test between selected excellent strain and recommended soybean species, almost tested strains were shown to have relatively broad host range rather than narrow specificity. 8) Nitrogen fixing bacteria isolated from rice field were cousidered to be Azospirillum sp. and other 2-3 kinds of species, which were classified into 3 groups depending upon the nitrogen fixing activity. 9) 2 strains of Agrobactericum sp.containing Ti plasmid were isolated for exploration of plant vector, and they were determined to be octopine type. From above results, excellent nitrogen fixing Rhizobium were selected and their genetic transfer system were established to make molecular development of Rhizobium sp.possible. The inoculation effect of selected strains in the field test suggested promising application as soybean inoculant. In this point of view, powerful symbiotic Rhizobium strain to be constructed by molecular development techniques as previous description should be tested further in the various areas of domestic field for determining applicability as soybean inoculant, which could be possible only on the basis of long term support from government .2. The development of cellulolytic and ethanol producing strains for energy production. Cellulase genes have been isolated successfully. Fortunatey, all parts of the cellulase gene were located on certain part of the chromosome in a series instead of being scattered in various parts of the chromosome and this made the isolation possible. The development of selection medium together with the combined use of the medium and the existing method of Congo Red dye also facilitated the isolation of cellulase genes. Three types of new hybrid plasmids containing· cellulase genes have been constructed : pBS2115, containing B.stearothermophilus gene : pDH73, containing B.subtilis gene : and pCK54, containing cellulase gene of C. fimi. Using the above hybrid plasmids the future studies should be directed as follows : (1) further cloning of β-glucosidase gene on the new hybrid plasmids, (2) transfer of the constructed plasmids into Zymomonas cells, and (3) increase of cellulase gene activity by adding effective promotors to the operator region of the cellulase gene. The study should be continued until the production of ethanol from cellulosic raw materials through a single stepoperation using newly created strains of Zymomonas.

목차 Contents

• 제 1 장 에너지대체를 위한 질소고정균의 육종...33
• 제1절 서 론...35
• 제2절 Rhizobium의 nif와 nod gene cloning에 관한 연구...40
• 1. 서 론...40
• 2. 재료 및 방법...42
• 3. 실험결과 및 고찰...51
• 가. Rhizobium 균주의 수집 및 분리...51
• 나. Plasmid 확인 및 molecular weight 결정...51
• 다. Nif와 nod gene의 위치 결정을 위한 curing test...56
• 라. Transposon Tn 5에 의한 mutant bank 작성...59
• 마. R.japonicum의 spheroplast 형성조건 확립...61
• 바. R.japonicum의 nif, nod gene hybridization...73
• 사. Nodule extract의 아미노산 조성 및 free-living상태에서의 질소고정 활성...80
• 4. 요 약...85
• 제3절 Legume-Rhizobium간의 공생질소고정 기작에 관한 연구...87
• 1. 서 론...87
• 2. 재료 및 방법...88
• 3. 실험결과 및 고찰...96
• 가.$NH_4$-N 농도가 근류형성능에 미치는 영향...96
• 나. Inoculum size가 질소고정활성 및 근류형성능에 미치는 영향...98
• 다. 대두장려품종과 근류균간의 숙주친화성...100
• 라. 선발우수 Rhizobium균주의 접종효과...112
• 1) Pot 시험...112
• 2) 포장시험...120
• 마. 근류균의 항체조제 및 응집반응...122
• 바. 주요 선발균주의 항생제 내성조사...124
• 4. 요 약...126
• 제4절 수도작관련 질소고정균에 관한 연구...127
• 1. 서 론...127
• 2. 재료 및 방법...128
• 3. 실험결과 및 고찰...129
• 4. 요 약...132
• 제5절 질소고정유전자의 vector system 개발...132
• 1. 서 론...132
• 2. 재료 및 방법...134
• 3. 실험결과 및 고찰...136
• 4. 요 약...141
• 참고문헌...142
• 제 2 장 질소고정균 Rhizobium을 위한 유전자 조작 system의 개발...153
• 제1절 연구목적 및 중요성...155
• 제2절 연구개발의 내용 범위 및 방법...156
• 1. 연구내용 및 범위...157
• 가. 균주 및 plasmid의 수집...157
• 나. Plasmid DNA의 추출 및 정제...157
• 다. Plasmid DNA에 의한 형질전환...158
• 라. Rhizobium에서의 cloning system 확립...158
• 2. 재 료...158
• 가. 사용균주 및 plasmid...158
• 나. 배 지...161
• 다. 시 약...162
• 라. 완충용액 및 solution...162
• 3. 방 법...164
• 가. DNA분리 및 정제...164
• 나. Transformation...164
• 다. 도입된 숙주에서의 plasmid 확인 및 분리정제...168
• 라. Restriction mapping...168
• 마. Agarose gel electrophoresis...169
• 바. Methylene blue test...169
• 사. $Hup^{+}$ gene의 cloning과 도입 및 발현...169
• 제3절 연구개발 결과 고찰 및 활용에 관한 건의...173
• 1. 결 과...173
• 가. Transformation 및 Frequency...173
• 나. Plasmid 존재확인...175
• 다. 도입된 plasmid 형태확인...175
• 라. Transformants의 phenotype 변화...175
• 마. DNA의 재조합...182
• 바. 재조합 DNA의 transformation과 Rhizobium meliloti의 hup+ gene(s) 발현균주 선별...182
• 사. hup+ gene발현균주의 재조합 DNA 확인...182
• 2. 고찰 및 활용에 관한 건의...186
• 제4절 요 약...187
• 참고문헌...189
• 제 3 장 벼뿌리에 서식하는 질소고정 미생물에 관한 연구...191
• 제1절 서 론...193
• 제2절 재료 및 방법...194
• 1. 논토양 채취 및 질소고정 미생물의 분리...194
• 2. 질소고정활성 측정...195
• 3. Plasmid 분리 및 전기영동...195
• 4. 항생물질 내성검사...195
• 5. Nitrocellulose membrane에 DNA의 blotting...195
• 6. Probe DNA의 조제...196
• 7. Hybridization 실시...196
• 제3절 실험결과 및 고찰...197
• 1. 질소고정미생물의 분리...197
• 2. Plasmid 함유 여부 조사...198
• 3. 항생물질 내성 검사...200
• 4. 질소고정유전자의 위치 파악...201
• 5. K.pneumoniae M5al 질소고정유전자와의 DNA homology 비교...203
• 제4절 결 론...213
• 참고문헌...214
• 제 4 장 에너지 생산을 위한 섬유소 분해균 및 알콜 생산균의 육종...219
• 제1절 서 론...221
• 1. 연구개발의 목적과 범위...221
• 2. 역사적 배경...221
• 제2절 본 문...222
• 1. 섬유소 분해능 검출방법의 개발...222
• 2. 유전자 공여균의 선택...223
• 3. 섬유소 분해 유전자의 분리...225
• 가. B.stearothermoghilus의 섬유소 분해 유전자를 pBR322에 옮김...225
• 나. B.subtilis의 섬유소 분해 유전자를 pBR 325에 옮김...229
• 다. Cellulomonas fimi의 섬유소 분해 유전자를 pBR322에 옮김...234
• 4. 유전자지도의 작성...234
• 가. B.stearothermophilus의 섬유소 분해 유전자를 가진 plasmid의 유전자지도...234
• 나. Cellulomonas fimi 섬유소 분해 유전자를 가진 plasmid의 유전자지도...237
• 다. B.subtilis섬유소 분해 유전자를 가진 plasmid의 유전자지도...239
• 제3절 결론 및 건의 사항...240
• 1. 결 론...240
• 2. 건의사항...241
• 제 5 장 세포 융합법에 의한 섬유소 분해균 분자육종에 관한 연구...243
• 제1절 서 론...245
• 제2절 재료 및 방법...246
• 1. 사용세균균주...246
• 2. 배지조성...246
• 3. 영양요구주의 분리방법...248
• 4. Protoplast화 방법 및 확인법...249
• 5. Protoplast regeneration...249
• 6. Protoplast fusion 방법...250
• 제3절 실험결과 및 고찰...250
• 1. 영양요구주의 분리...250
• 2. 원형질체의 형성...251
• 가. lysozyme 농도 및 시간이 원형질체 형성에 미치는 영향...252
• 나. 원형질체 형성에 있어서 penicillin G 처리효과...252
• 다. 원형질체 형성에 적합한 증식 시기...254
• 3. 원형질체의 재생...255
• 4. 원형질체 융합...257
• 참고문헌...260