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문제 정의
- 따라서 본 연구는 소곡주 제조에 영향을 미칠 수 있는 균류에 대한 기초 정보를 얻고자 소곡주 제조 공장에서소곡주 제조에 사용되는 누룩과 함께 공장의 여러 시설 내의 공기로부터 균류를 분리하여 어떠한 균류가 존재하는지 조사 분석하였다.
- 가 분리되어졌다. 본 연구는 국내에서는 처음으로 전통주 제조 공장의 실내 공기 중에 존재하는 균류상에 대한보고이다.
- 본 연구에서는 우리나라 전통술의 하나로서 충남지방무형문화재로 지정되었고 여러 문헌에서 대체로 으뜸으로 평가 받는 소곡주를 대상으로 그 제품이 만들어지는 과정을 따라 공장의 여러 공간에 존재하는 공기 중의 균류를 조사하였다. Fig.
제안 방법
- Nuclear rDNA 상에 존재하는 ITS1-5.8S-ITS2 rDNA부위에 대한 PCR 증폭은 universal primer pairs인 ITS1・ ITS4(White et al., 1990) 보다 18S rDNA region이 약간 더 증폭되는 ITS1F-ITS4 primer(Kim et al., 1999)를 이용하였고 PCR 반응조성은 총 50" 반응용액에 대해 fungal genomic DNA 200 ng, 각 primer 20 pmol, 4종의 각 deoxynucleotide triphosphates(dNTPs) 10 mM, 1X PCR buffer(10 mM Tris-Cl[pH 8.0], 1.5 mM MgCl2, 50 mM KC1), 1 unit Thermostable polymerase(Solgent Corp.) 를 사용하였다. 반응은 Gene Amp-950 thermal cycler (ABI, USA)를 이용하여 앞서 수행한 Kim 등(1999)의 조건에 따라 수행하였다.
- 공기 채집은 오후 2시경에 충돌식 미생물채집기인 앤더슨 채집기(Anderson sampler, 켐익코리아)를 이용하여 2단으로 감자한천배지(PDA plate, Difco)를 설치한 후 각각 1분간 3회 반복으로 채집하였다. PDA plate에는 항생제 인 ampicillin을 50~100 jug/ml 농도로 첨가하여 세균 성장을 억제함으로써 균류의 순수분리를 꾀하였다. 포집된 공기 시료는 즉시 실험실로 가져와 25℃ 배양기에 설치 후 매일 오전 10시 및 오후 4시에 2 회에 걸쳐 자라나오는 균사의 분리를 실시하였다.
- 증폭된 PCR 반응산물은 1% agarose gel에서 밴드를 확인 후 겔 분리키트(Qiagen)를 사용하여 다시 분리 한 후 Topo-T vector(Invitrogen)에 클로닝하고 Macrogen 사에 염기서열분석을 의뢰하여 분석 결과를 얻었다. 결정된 염기서열은 GenBank DNA database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 에 있는 blastN 프로그램을 이용하여 그 유사도를 검색 비교하였다.
- 곡주를 제조하기 위하여 사용되는 발효제인 누룩을 오랫동안 사용하면 누룩에 존재하던 균류가 소곡주 공장의 공기 중에 존재할 가능성이 있어 이를 알아보고자 공장에서 보통 주문하여 쓰는 누룩으로부터 균류의 분리를 시도하였다. 배지에 접종된 누룩으로부터 피어나는 균류는 기 균사를 대부분 형성 하였다(Fig.
- 공기를 채집하였다. 공기 채집은 오후 2시경에 충돌식 미생물채집기인 앤더슨 채집기(Anderson sampler, 켐익코리아)를 이용하여 2단으로 감자한천배지(PDA plate, Difco)를 설치한 후 각각 1분간 3회 반복으로 채집하였다. PDA plate에는 항생제 인 ampicillin을 50~100 jug/ml 농도로 첨가하여 세균 성장을 억제함으로써 균류의 순수분리를 꾀하였다.
- 1개 plate 당 뚜렷하게 자라나와 분리된 균류의 평균 균주의 수는 Table 3과 같다. 균류 조사 때 plate에 뚜렷하게 집락을 보인 세균의 집락도 같이 조사하였다. 균류의 분리 빈도는 수입밀 보다 우리나라에서 재배한 밀로 만든 누룩에서 다소 높았다.
- 균류를 분리하기 위해서 가루 형태로 도착한 2가지(우리 밀, 수입밀) 누룩으로부터 각각 2 g을 취하여 PDA 배지에 직접 균일하게 퍼지게 뿌린 후 25℃에 배양하였으며 매일 10시, 16시 시각에 2회에 걸쳐 자라나오는 균사를 분리하였다.
- Cladosporium 속콰 Fusarium 속은 모두 동일한 형태를 가지는 그룹으로 나타나 Cladosporium spl 와 Fusarium spl으로 각각 표시하였다(Table 1). 그 후 그룹으로 나누어진 균주들을 대상으로 분자적 동정을 실시하였다. 형태적으로 유사한 각 그룹에서 균주 2개씩을 대표로 선정하여 ITS rDNA를 분석하였다.
- 내부로부터 균을 분리하기 위해서 앞서 기술한 2가지 누룩 2 g을 멸균된 유발에 넣고 유봉으로 고르게 분쇄 후 PDA 배지에 직접 균일하게 퍼지게 뿌린 후 25℃에 배양하면서 매일 10시 및 16시 시각에 2회에 걸쳐 자라나오는 균사를 분리하였다.
- 본 실험을 위해서는 국외에서 수입된 수입밀과 우리나라에서 재배하여 수확된 밀(우리밀)을 재료로 하여 동일한 누룩 제조공장에서 동일한 방법으로 제조된 것을 사용하였다. 누룩에 서의 균류 분리는 아래와 같이 두 가지 방법으로 나누어 분리를 시도하였다.
- 순수 분리된 균류의 균사는 PDA, 또는 맥아 추출한 천배지(MEA), 귀리추출한천배지(OA) 등에 접종하여 실온에서 배양하면서 접종 3일 후부터 10일간 배양하면서 배지에 자란형태 및 균총의 모양과 색, 균사의 특징 등을 관찰하였고 미세구조는 광학현미경(Karl Zeiss, Axioskop 40 모델)을 사용하여 균사 및 포자형태 등을 관찰하였다. 균류의 형태적 동정은 The Identification of Fungi(Dugan, 2006), Illustrated Genera of Imperfect Fungi(Bamett and Hunter, 1998), Atlas of Clinical Fungi(de Hoog et al.
- 이에 따라 Table 2에 얻어진 ITS rDNA 염기서열을 GenBank database0, ] 등록된 균류의 염기서열과 유사도 비교를 수행하였다. 유사도 검색은 highly similar sequence option을 사용하였고 그 결과 유사도가 높을수록 max score 값이 높게 나타나는 결과를 얻었다(Table 2).
- 전통주인 소곡주 공장의 실내공기에 존재하는 균류 상을 조사하기 위하여 앤더슨 공기 포집기를 이용하여 소곡 주공 장의 여러 방으로부터 포집된 공기와 이곳에서 주정 제조를 위해 사용해온 누룩으로부터 균류를 분리하고 분석하였다. Aspergilluse Penicillium, Gibberella.
- 반응은 Gene Amp-950 thermal cycler (ABI, USA)를 이용하여 앞서 수행한 Kim 등(1999)의 조건에 따라 수행하였다. 증폭된 PCR 반응산물은 1% agarose gel에서 밴드를 확인 후 겔 분리키트(Qiagen)를 사용하여 다시 분리 한 후 Topo-T vector(Invitrogen)에 클로닝하고 Macrogen 사에 염기서열분석을 의뢰하여 분석 결과를 얻었다. 결정된 염기서열은 GenBank DNA database (http://www.
- PDA plate에는 항생제 인 ampicillin을 50~100 jug/ml 농도로 첨가하여 세균 성장을 억제함으로써 균류의 순수분리를 꾀하였다. 포집된 공기 시료는 즉시 실험실로 가져와 25℃ 배양기에 설치 후 매일 오전 10시 및 오후 4시에 2 회에 걸쳐 자라나오는 균사의 분리를 실시하였다.
- 1에 나타난 바와 같이 앤더슨 포집기를 이용하여 공기를 포집하여 장착된 MEA 배지에 노출시킨 후 배지를 3일간 배양시킨 결과 균류의 집락이 형성된 것을 볼 때 공기 중에 균류의 포자가 존재함을 추정 할 수 있었다. 한 개의 plate 배지에 검출된 균류의 집락이 유사하면서 많은 관계로 계수하기가 곤란하여 plate 면적을 8둥분 한 후 1둥분면적에 존재하는 균류를 분리하여 균주 수를 계수하였으며 3반복으로 진행된 결과의 평균값을 Table 1에 나타내었다. 균류의 분리는 밑술실 (crude liquor-making room), 여과실(filtering room), 증자실 (harcJboiled rice-making room) 등에서 사입실 (mixing room), 저장실 (storage & aging room), 실험실(laboratory) 등 보다 더 높게 분리되었다.
- 그 후 그룹으로 나누어진 균주들을 대상으로 분자적 동정을 실시하였다. 형태적으로 유사한 각 그룹에서 균주 2개씩을 대표로 선정하여 ITS rDNA를 분석하였다. 실험에 사용한 primer 를 이용하여 PCR 반응 후 증폭된 band의 크기는 대략 540 bp에서 580 bp에 이르는 단일 밴드였다.
대상 데이터
- 2005년 10월부터 12월 사이 충청남도 한산지역에 소재한소곡주 공장을 방문하여 소곡주 제조 과정의 순서에 따라 사용되는 사입실, 밑술실, 증자실, 여과실, 숙성실, 실험실 등에서 공기를 채집하였다. 공기 채집은 오후 2시경에 충돌식 미생물채집기인 앤더슨 채집기(Anderson sampler, 켐익코리아)를 이용하여 2단으로 감자한천배지(PDA plate, Difco)를 설치한 후 각각 1분간 3회 반복으로 채집하였다.
- 누룩 자체는 밀로 제조하는 것으로 소곡주공장의 경우 과거에는 국내에서 생산된 밀로 제조 되다가 국내 밀 재배가 줄어들면서 국외에서 수입된 밀(수입밀)을 이용하여 누룩을 제조한 것을 공급 받아 사용하고 있었다. 본 실험을 위해서는 국외에서 수입된 수입밀과 우리나라에서 재배하여 수확된 밀(우리밀)을 재료로 하여 동일한 누룩 제조공장에서 동일한 방법으로 제조된 것을 사용하였다. 누룩에 서의 균류 분리는 아래와 같이 두 가지 방법으로 나누어 분리를 시도하였다.
- 소곡주 공장에서 사용되는 누룩은 원래 경상도 지역의 누룩 공장에서 제조되어 상업적으로 공급된 것으로 오랫동안 공장에서 사용되어져 왔었던 누룩을 사용하였다. 누룩 자체는 밀로 제조하는 것으로 소곡주공장의 경우 과거에는 국내에서 생산된 밀로 제조 되다가 국내 밀 재배가 줄어들면서 국외에서 수입된 밀(수입밀)을 이용하여 누룩을 제조한 것을 공급 받아 사용하고 있었다.
이론/모형
- 사용하여 균사 및 포자형태 등을 관찰하였다. 균류의 형태적 동정은 The Identification of Fungi(Dugan, 2006), Illustrated Genera of Imperfect Fungi(Bamett and Hunter, 1998), Atlas of Clinical Fungi(de Hoog et al., 2000), Introduction to Food-and Airborne Fungi Seventh Edition(Samson et al., 2004), Identification of common Aspergillus Species(Klich, 2002), Penicillium subgenus Penicillium: new taxonomic schemes, mycotoxins and other extrolites(Samson and Frisvad, 2004) 등의 서적을참조로 하였다.
- ) 를 사용하였다. 반응은 Gene Amp-950 thermal cycler (ABI, USA)를 이용하여 앞서 수행한 Kim 등(1999)의 조건에 따라 수행하였다. 증폭된 PCR 반응산물은 1% agarose gel에서 밴드를 확인 후 겔 분리키트(Qiagen)를 사용하여 다시 분리 한 후 Topo-T vector(Invitrogen)에 클로닝하고 Macrogen 사에 염기서열분석을 의뢰하여 분석 결과를 얻었다.
- 분자적 동정을 위해서는 셀로판지를 깔은 PDA 배지에 균을 접종 후 25℃에서 5일간 배양한 다음 셀로판지 위에 자란 균사를 살균된 메스를 이용하여 수확한 후 드릴을 이용하여 Kim 둥(1999)의 방법에 따라 genomic DNA를 분리하여 사용하였다.
성능/효과
- sclemtiorum으로 Penicillium sp7은 P gr사)rum으로 각각 동정되었다. Aspergillus sple A. awamori 및 A. niger, A. tubingensis와 동일한 유시도 값을 나타내었고 Aspergillus sp3는 A. oryzae, A. fla- vus 등과 동일한 유사도 값을 나타내어 분자적 동정을 내리기 어려웠다. 따라서 Aspergillus spl과 Aspergillus sp3 그룹에 대해서는 calmodulin 유전자 분석이나 여러 배지에 키운 성상을 비교하는 연구를 통하여 추가적인 연구가 필요하다.
- 1은 소곡주 공장의 조사된 여러 방중에두 개의 방에서 포집한 결과를 예로 나타낸 것이다. Fig. 1에 나타난 바와 같이 앤더슨 포집기를 이용하여 공기를 포집하여 장착된 MEA 배지에 노출시킨 후 배지를 3일간 배양시킨 결과 균류의 집락이 형성된 것을 볼 때 공기 중에 균류의 포자가 존재함을 추정 할 수 있었다. 한 개의 plate 배지에 검출된 균류의 집락이 유사하면서 많은 관계로 계수하기가 곤란하여 plate 면적을 8둥분 한 후 1둥분면적에 존재하는 균류를 분리하여 균주 수를 계수하였으며 3반복으로 진행된 결과의 평균값을 Table 1에 나타내었다.
- ochraceuse. Fusarium sple Gibberella avenaceae- 그리고 Penicillium sple P. olsonii로 Penicillium sp2는 P. paneume, Penicillium sp3는 Talaromyces flavus로 Penicillium sp4는 P. corylo-philum으로 Penicillium sp5는 P. sclemtiorum으로 Penicillium sp7은 P gr사)rum으로 각각 동정되었다. Aspergillus sple A.
- 결론으로, 소곡주 공장의 공기 중에 곡자에 유용한 것으로 알려진 누룩균류들이 널리 존재하고 있음을 알 수 있었다. 좋은 곡자는 좋은 술을 만드는데 귀중한 재료이므로 장기간 주정을 해온 곳의 공기 중에 존재하는 좋은곡자를 만드는 균류에 대한 정보는 주정공장에서 누룩을 자가제조하거나 주정 제조과정 중 오염균이 있는지 모니터링 하는데 유용한 기초 자료가 될 것으로 기대된다.
- 이러한 성향은 누룩을 곱게 갈아서 분리하던 알갱이로 분리하던 비슷한 양상이었다. 누룩에서 분리된 균주를 순수 배양하여 본 결과 사상균 균총을 이룬 배지에서 관찰된 균류는 모두가 형태적으로는 Aspergillus 또는 Rhizopus 균류의 성상으로 나타났다. 이들 두 가지 성상의 균류에 대하여 종 수준까지 알아보고자 임의적으로 8개 균주씩을 각각 선택하여 ITS rDNA 염기서열을 조사한 결과 모두 Aspergillus sp3 그룹과 Rhizopus sp로 동정 되었다(Fig 3).
- 특히 Aspergillus oryzaee: 일반적으로 누룩곰팡이로 잘 알려져 있다. 소곡주가 찹쌀과 멥쌀을 주원료로 하여 담가지는 것을 볼 때 A. awamorie- A. oryzae7\ 이들 쌀 종류의 기질이 많이 노출된 증자실, 밑술실, 사입실, 여과실 등에서 나타나는 것으로 보여 진다. 즉 이들 균류가 많이 번식할 수 있는 조건을 소곡주 공장이 가지고 있는 것으로 사료된다.
- 수행하였다. 유사도 검색은 highly similar sequence option을 사용하였고 그 결과 유사도가 높을수록 max score 값이 높게 나타나는 결과를 얻었다(Table 2). 이 중 가장 수치가 높게 나온 3개의 ITS rDNA 유전자 부위에 대해 순서대로 해당 균류의 이름과 GenBank accession number를 Table 2에 제시하였다.
- 이는 같은 누룩제조 공장에서 제조되기 때문에 같은 균류가 나오는 것으로 사료된다. 이 결과로 볼 때 소곡주 공장의 공기 중에 고루 분포하는 Aspergillus 균류는소곡주 제조 과정에 사용하는 누룩에서 유래할 가능성이 높아 보인다. 또 하나의 흥미로운 사실은 밀로 제조한 누룩에 Rhizopus sp가 누룩에 많이 존재하는데 본 연구 조사에서는 Table 1과 2에서 보여주듯이 공기 중에서 이들 균류가 검출되지 않은 사실이다.
- 이들 균주들을 순수 분리하여 배지 상에서 자라는 형태와 현미경 관찰을 수행한 결과 일반적으로 공기 중에 빈도가 높게 나타나는 Aspergillus, Cladosporium, Penicil- lium 속 등에 속하는 균류와 Fusarium 속에 속하는 균류가 존재하였다. 이들 균류들은 배지 상에서 나타나는 모양과 색에 따라 형태적으로 유사한 균주들을 묶어서 몇 개의 그룹으로 나눌 수 있었다.
- 누룩에서 분리된 균주를 순수 배양하여 본 결과 사상균 균총을 이룬 배지에서 관찰된 균류는 모두가 형태적으로는 Aspergillus 또는 Rhizopus 균류의 성상으로 나타났다. 이들 두 가지 성상의 균류에 대하여 종 수준까지 알아보고자 임의적으로 8개 균주씩을 각각 선택하여 ITS rDNA 염기서열을 조사한 결과 모두 Aspergillus sp3 그룹과 Rhizopus sp로 동정 되었다(Fig 3). 따라서 수입밀로 제조하나 우리밀로 제조하나 누룩에 존재하는 균류의 종류는 비슷함을 알 수 있었다.
- glabrum 등 5종이 검출 되었다. 이들 종들은 사입실을 제외하고는 다른 조사된 모든 방에서 검줄되 었는데 사입실에서 검출된 Talaromyces fla-vus가 Penicillium dcmgeardii의 완전세대임을 고려하면 조사된 6개 방 모두에서 검출된 셈이다. 흥미롭게도 각 방마다 존재한 Penicillium은 모두 서로 상이하였다.
- 2에 나타내었다. 전체적으로 결정된 ITS rDNA의 크기는 작게는 535 bp에서 부터 크게는 595 bp였다. Aspergillus 속에 속하는 그룹의 경우는 574, 582, 592 bp 크기를 가지고 있었고 Penicillium 속에 속하는 그룹의 경우는 558, 570, 571, 572, 573, 584 bp의 크기를 가지고 있었다.
후속연구
- commune 등과 동일한 유사도를 보여 이들에 대한 분석도 elongation Itz 유전자 분석을 비롯한 좀 더 연구가 필요하다. Cladosporium의 경우도 3개의 종이 같은 값을 보여 ITS rDNA 분석으로는 구분이 어려워 다른 부분의 유전자 분석이 병행되어야 할 것이다.
- expansum. P. commune 등과 동일한 유사도를 보여 이들에 대한 분석도 elongation Itz 유전자 분석을 비롯한 좀 더 연구가 필요하다. Cladosporium의 경우도 3개의 종이 같은 값을 보여 ITS rDNA 분석으로는 구분이 어려워 다른 부분의 유전자 분석이 병행되어야 할 것이다.
- fla- vus 등과 동일한 유사도 값을 나타내어 분자적 동정을 내리기 어려웠다. 따라서 Aspergillus spl과 Aspergillus sp3 그룹에 대해서는 calmodulin 유전자 분석이나 여러 배지에 키운 성상을 비교하는 연구를 통하여 추가적인 연구가 필요하다. Penicillium의 경우는 Penicillium sp6가 P.
- 소곡주는 찹쌀과 멥쌀로만 주정을 하고 장기간 저온 숙성을 하기 때문에 Aspergillus균에 비하여 Rhizopus균이 증식할 환경이 다소 제한되어 공기 중에 Rhizopus균이 분포할 가능성이 적어진 것으로 사료된다. 밀로 누룩을 제조하는 누룩공장에서의 공기 중에는 어떠한 균상이 존재하는지 조사한다면 재미있는 비교 정보가 될 것으로 보여 진다.
- 좋은 곡자는 좋은 술을 만드는데 귀중한 재료이므로 장기간 주정을 해온 곳의 공기 중에 존재하는 좋은곡자를 만드는 균류에 대한 정보는 주정공장에서 누룩을 자가제조하거나 주정 제조과정 중 오염균이 있는지 모니터링 하는데 유용한 기초 자료가 될 것으로 기대된다. 더불어 주정공장의 실내공기가 유용한 발효 미생물 자원을 얻을 수 있는 환경 임을 본 연구는 시사하였다.
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