초록 ▼

본 연구에서는 항암효능을 지닌 한약재를 암세포주를 이용하여 스크리닝하고, 항암활성 유효성분을 순수 분리하여 그 구조를 규명하였다. 또한 한의학적 원리에 입각하여 구성된 한방처방의 항암효능 및 화학항암제 부작용 억제효능을 동물실험을 통해 규명하였으며 한약재 성분물질 및 지표물질에 의한 암세포 자살(apoptosis) 유도 효능에 대한 연구가 수행되었다. 산자고를 비롯한 23가지 한약재의 AGS 인간 위암세포주에 대한 세포 독성 실험결과는 마황의 열수 추출물, 자근과 홍화의 메탄올 추출물, 그리고 반지련, 인종쑥, 인진, 파두의 열수

본 연구에서는 항암효능을 지닌 한약재를 암세포주를 이용하여 스크리닝하고, 항암활성 유효성분을 순수 분리하여 그 구조를 규명하였다. 또한 한의학적 원리에 입각하여 구성된 한방처방의 항암효능 및 화학항암제 부작용 억제효능을 동물실험을 통해 규명하였으며 한약재 성분물질 및 지표물질에 의한 암세포 자살(apoptosis) 유도 효능에 대한 연구가 수행되었다. 산자고를 비롯한 23가지 한약재의 AGS 인간 위암세포주에 대한 세포 독성 실험결과는 마황의 열수 추출물, 자근과 홍화의 메탄올 추출물, 그리고 반지련, 인종쑥, 인진, 파두의 열수 및 메탄올 추출물에서 효능이 관찰되었다. 전년도의 연구를 통하여 암세포 성장억제효능, in vivo 항암효능, 면역증강효능, 암세포자살유도 효능이 규명된 한약재 소목으로부터 항암활성 성분을 AGS 위암세포주에 대한 세포독성 활성을 보면서 유기용매 추출, 2회의 칼럼 크로마토그래피와 TLC, 재결정의 방법으로 분리하여 순수분리 성분 물질 SM13-1을 얻었다. 질량스펙트럼과 H-NMR, 13C-NMR 분석을 통하여 SM13-1의 화학구조를 분석하였다. 질량스펙트럼 분석 결과, SM13-1의 분자량이 272임을 알 수 있었다. H-NMR과 13C-NMR 스펙트럼 데이터는 SM13-1의 구조가 protosappanin A임을 증명하였다. Protosappanin A는 AGS 인간위암세포주에 대한 IC50 값이 0.012 ㎍/㎖로서 camptothecin (IC50 = 0.080 ㎍/㎖), etoposide(IC50 = 2.5 ㎍/㎖), cisplatin(IC50 > 50 ㎍/㎖)등 기존 항암제에 비해 각각 6.7배, 200배, 4000배 이상 우수한 세포독성 효능을 보였다. 또한 HL60 인간 급성 백혈병 세포주에서는 0.1 ㎍/㎖의 농도에서 세포자살(apoptosis)를 일으킨 반면, 0.3 ㎍/㎖ 이상의 농도에서는 세포괴사(necrosis)를 일으켰다. Protosappanin A에 의한 세포자살과정에 있어서는 핵심 조절자 역할을 하는 caspase들 중에서 caspase-2와 caspase-3 만이 선별적으로 관여함이 관찰되었다. 본 연구 결과는 protosappanin A의 생리학/약리학적 효과에 대한 최초의 보고로서 protosappanin A가 기존 항암제 보다 월등히 우수한 효능의 항암제로 개발될 수 있음을 제시하고 있다. 또한 항암효능을 지닌 소목 추출물의 유효성분을 규명함으로써 소목추출물의 한방신약 개발을 위한 유효성분 함량기준 설정에 이용될 수 있다. 본 연구의 또 다른 목표는 암치료에 있어서 한방처방의 효능을 검증하고 유효 처방을 찾아내어 임상치료에의 응용을 추구하는 것이다. 위암에 대한 한의학적 방제원리에 의해 구성된 한방탕제 KBT는 암생존기간을 41 % 증가시키고 암성장과 암전이를 각각 33.8 %와 31.8 % 억제하여 항암효능이 있음이 관찰되었다. 또한 活血祛瘀의 효능을 목적으로 구성된 한방탕제 HHD와 HHDJ는 cisplatin에 의한 조혈계 부작용 중 혈소판 감소증을 유의성 있게 억제하였다. 이는 화학항암제에 의한 조혈계 부작용과 병리학적 혈액산물인 瘀血과의 상관성에 기초한 것으로, 한의학적 병리개념인 瘀血은 각종 병인에 의해 정상적인 생리기능을 상실한 혈액이 체내 일정부위에 응취되어 형성한 일종의 병리학적 산물로서 기혈운행에 영향을 미쳐 장부기능을 실조시킴으로써 다양한 질병을 야기하는 중요발병인자중의 하나이다. Cisplatin 부작용으로 인한 각 장부의 변화에 대한 회복효과를 간접적으로 측정하기 위하여 장부 중량을 측정하여 본 결과, HHD와 HHDJ는 cisplatin에 의해 감소된 간장, 신장, 비장의 중량을 통계적으로 유의성 있게 회복시켰다. 한약재의 효능에 대한 보다 과학적인 접근을 위하여 한약재의 성분물질 또는 지표물질의 효능에 대한 연구가 이루어 졌다. 苦, 寒의 성미를 지니고 心包, 肝經의 귀경을 지니며, 凉血, 活血, 淸熱, 解毒의 효능을 지닌 紫根(Lithospermi Radix, 紫草)의 주요 성분으로 등재 급성백혈병세포와 K562 만성백혈병세포에서는 각각 0.05 ㎍/㎖과 0.2 ㎍/㎖에서 효과를 보인 반면, SUN-1 위암세포와 HepG2 간암세포에서는 각각 3 ㎍/㎖과 10 ㎍/㎖에서 효과가 나타나 혈액의 암인 백혈병세포에 대한 효과가 탁월한 것으로 관찰되었다. 이와 같은 현상은 紫根의 凉血, 活血 효능이 혈액의 암인 백혈병의 치료에 유용하게 이용될 수 있음을 제시하고 있다. 苦, 微寒의 성미와 心,心包經의 귀경을 지니고 있으며 活血祛瘀, 凉血, 養血安神의 효능을 지니는 丹參(Salvia Miltiorrhizae Radix)의 주요성분물질이자 지표물질인 tanshinone IIA도 HL60와 K562 백혈병세포의 apoptosis를 유도하였다. Tanshinone IIA에 의한 apoptosis에 있어서 HL60 급성백혈병 세포와 K562 만성 백혈병세포를 비교한 결과 두 세포 모두 1 ～ 3 ㎍/㎖ 농도에서 효과를 나타내어 tanshinone IIA에 대한 민감도에 있어서는 차이가 별로 없지만, HL60 급성 백혈병 세포는 4 시간의 처리에 의해 효과가 나타난 반면, K562 만성백혈병세포는 24 시간의 처리시간을 필요로 하여 반응시간의 차이를 나타내었다. Apoptosis의 핵심조절자인 caspase의 활성도 조절에 있어서도 HL60 세포에서는 caspase-2, caspase-3, caspase-6이 활성화 된 반면, K562 세포에서는 오직 caspase-3 만이 활성화되어 작용 메커니즘에 차이가 있음을 제시하였다. 한의학적 암치료법에는 부정고본법, 활혈화어법, 청열해독법, 화담거습법 등이 있으며 본 연구에서는 활혈화어 효능의 약재 및 처방의 효능이 규명되었다. 지속적인 연구를 통해 한의학적 암치료 원리를 과학적으로 규명한다면 국민건강증진과 고부가가치 한방신약 개발을 통한 국가 경제발전에 기여함과 동시에 한의학의 우수성을 입증하는 업적이 될 것이다.

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목차 Contents

• Ⅰ. 서론...8
• Ⅱ. 재료 및 방법...10
• 1. 실험재료...10
• 2. 한약재 시료의 조제...10
• 3. 세포배양 및 실험동물...15
• 3-1. 세포배양...15
• 3-2. 실험동물...15
• 4. 암세포주에 대한 세포독성 측정(SRB assay)...15
• 5. 암생존기간 연장효과 측정...15
• 6. 고형암 성장 억제효과 측정...16
• 7. 암전이 억제효과 측정...16
• 8. 화학항암제 부작용 억제효과 측정...16
• 8-1. 실험동물...16
• 8-2. 시약...17
• 8-3. 실험동물의 처리...17
• 8-4. Complete Blood Count(CBC)...17
• 9. 한약재로부터 항암활성물질의 순수 분리 및 구조 분석...17
• 10. Apoptosis 유도 실험...18
• 10-1. Internucleosomal DNA fragmentation...18
• 10-2. Flow cytometer 분석...18
• 10-3. Caspase 활성도 측정...19
• 10-4. Western blotting...19
• Ⅲ. 결과 및 고찰...20
• 1. 암세포주에 대한 세포독성 실험...20
• 1-1. 위암세포주(AGS)의 SRB 검색법을 위한 적정 세포수의 결정...20
• 1-2. 한약단미제의 위암세포주에 대한 세포독성 측정...20
• 2. 소목으로부터 항암활성 성분의 분리 및 구조 분석...23
• 2-1. 활성성분의 순수 분리 및 세포독성 효능...23
• 2-2. 활성성분 E13-1의 구조 분석...25
• 2-3. 활성성분 protosappanin A의 암세포 apoptosis 유도효능...29
• 2-3-1. Internucleosomal DNA fragmentation...29
• 2-3-2. Flow cytometer 분석...29
• 2-3-3. Caspase 활성도 측정...30
• 2-3-4. Trypane blue dye-exclusion test...31
• 3. 한방 처방의 항암효능에 대한 연구...48
• 3-1. KBT의 암 생존기간 연장 효과...49
• 3-2. KBT의 암 성장 억제 효과...51
• 3-3. KBT의 암 전이 억제 효과...53
• 4. 항암제 부작용에 대한 한방처방의 효능연구...55
• 4-1. 한방처방이 cisplatin에 의한 조혈계 부작용에 미치는 영향...58
• 4-1-1. 백혈구(WBC)에 미치는 영향...58
• 4-1-2. 적혈구(RBC)에 미치는 영향...60
• 4-1-3. 혈소판(PLT)에 미치는 영향...62
• 4-2. 한방처방이 cisplatin에 의한 체중 및 장기 중량에 미치는 영향...64
• 4-2-1. 체중에 미치는 영향...64
• 4-2-2. 간장 중량에 미치는 영향...66
• 4-2-3. 위장 중량에 미치는 영향...68
• 4-2-4. 신장 중량에 미치는 영향...70
• 4-2-5. 비장 중량에 미치는 영향...72
• 5. 한약재 구성 성분 물질에 의한 암세포 apoptosis 유도 연구...74
• 5-1. Acetylshikonin의 암세포 apoptosis 유도 효능 연구...76
• 5-1-1. 세포의 형태적 변화...77
• 5-1-2. Internucleosomal DNA fragmentation...80
• 5-1-3. Flow cytometer 분석...80
• 5-1-4. Poly(ADP-ribose) polymerase(PARP)의 특이적 절단...81
• 5-1-5. Caspase 활성도 측정...88
• 5-2. Tanshinone ⅡA에 의한 apoptosis에 관한 연구...96
• 5-2-1. Internucleosomal DNA fragmentation...97
• 5-2-2. Flow cytometer 분석...100
• 5-2-3. RARP의 특이적 절단...100
• 5-2-4. Caspase 활성도 측정...103
• Ⅳ. 결론...116
• Ⅴ. 참고문헌...119
• Ⅵ. 연구결과의 논문게재 및 학술회의 발표...123