초록 ▼

3 차년도 인슈린 과제의 연구 내용및 범위는 1 차년도의 연구를 통해 사람 인슈린 유전자의 설계, 합성과 미생물 내 도입 등에 이어 2 차년도, 인슈린 유전자 발현과 함께 숙주세포의 안정화를 하였고, 3 차년도에는 유전자 산물의 최대화및 안정화, 정제의 용이성 등을 고려한 여러 시도로 최적의 발현조건을 확보하였다. 얻어진 인슈린 융합 단백질 산물을 정제(융합 단백질의 정제)하고, 시안화 브롬을 처리하여, 각 사슬을 다시 정제하였다. 이어서 인슈린의 최종적 재조립을 시도하였다.1) tac promoter와 fusion에 의한 인슈린

3 차년도 인슈린 과제의 연구 내용및 범위는 1 차년도의 연구를 통해 사람 인슈린 유전자의 설계, 합성과 미생물 내 도입 등에 이어 2 차년도, 인슈린 유전자 발현과 함께 숙주세포의 안정화를 하였고, 3 차년도에는 유전자 산물의 최대화및 안정화, 정제의 용이성 등을 고려한 여러 시도로 최적의 발현조건을 확보하였다. 얻어진 인슈린 융합 단백질 산물을 정제(융합 단백질의 정제)하고, 시안화 브롬을 처리하여, 각 사슬을 다시 정제하였다. 이어서 인슈린의 최종적 재조립을 시도하였다.1) tac promoter와 fusion에 의한 인슈린 유전자의 발현 인슈린 유전자 앞에 tac promoter를 도입하고, β-galactosidase의 Pst I 위치에 인슈린 유전자를 C-terminal fusion을 하여 IPTG induction으로 유도하여 발현을 최적화하고 인슈린 사슬의 정제를 용이하게 하였다.2) 융합 단백질의 정제 배양한 세포들에 대해 초음파 파쇄기로 파쇄한 다음, 원심분리, urea, Triton X-100으로 세척하고 다시 원심분리하여 순수한 융합단백질을 얻어내었다. 이러한 단백질 정제방법은 일반적인 방법인 column chromatography와 병행하여 정제상의 용이성, 공정상 소요시간과 비용등을 비교하였다.3) 시안화 브롬의 처리와 각 사슬의 정제 Formic acid(70% v/v)를 용매로 하여 시안화 브롬 용액을 융합단백질에 대해 100배의 몰 비로 넣어주고 상온에서 24시간 동안 반응시켰다. 진공하에서 농축한 후 SDS-Urea-PAGE로 잘린 정도를 확인하고 Sephadex G-50 gel filtration chromatography를 실시하여 각 사슬을 분리 정제하였다.4) 사슬의 sulfitolysis와 재조립 Sodium sulfite, sodium tetrathionate를 이용하여 사슬의 티올기에 sulfonation킨 다음, 다시 β-mercaptoethanol로 환원시킨 후, 진공에서 산화시켜 재조립시켰다.

Abstract ▼

In a continuing study of human insulin, synthetic genes for human insulin A, B chains and proinsulin were seperately cloned in plasmid pUC 19. The cloned synthetic genes were then fused to an Escherichia coli β-galactosidase gene to provide efficient transcription and translation and to form a stabl

In a continuing study of human insulin, synthetic genes for human insulin A, B chains and proinsulin were seperately cloned in plasmid pUC 19. The cloned synthetic genes were then fused to an Escherichia coli β-galactosidase gene to provide efficient transcription and translation and to form a stable precursor protein. It was observed that the inclusion body in E. coli was formed after their gene expressions. The purifications of the gene products were initially adjusted to the classical chromatographic methods. And then the gene products in the form of inclusions body were purified by the urea-acetone treatment developed here. The intact insulin chains were isolated from cyanogen bromide cleavage of the fused gene products containing partial β-galactosidase with cyanogen bromide. Purification of the intact insulin chains B and A were achieved and confirmed by HPLC. Sulfitolysis of each chain with sodium sulfite and sodium tetrathionate gave their sulfonated products, with which reconstitution was attempted. The presence of insulin was detected by HPLC.

목차 Contents

• 제1장 서론...13
• 제2장 실험재료 및 방법...16
• 제1절 실험재료 및 기기...16
• 1. 균주...16
• 2. 배지 및 완충용액...16
• 3. 효소 및 생화합물...17
• 4. 기기...18
• 제2절 실험방법...18
• 1. Oligonucleotide의 화학합성...19
• 2. Plasmid의 분리 및 transformation...19
• 3. 서열분석...19
• 4. 발현...20
• 5. SDS-PAGE...20
• 제3장 발현의 최적화와 융합 단백질의 정제...21
• 제1절 인슈린 유전자의 발현...21
• 1. 벡터의 재조합...21
• 2. β-Gal'-인슈린 유전자의 발현...21
• 제2절 Proinsulin의 Cloning과 발현...26
• 1. Proinsulin gene construction과 Cloning...27
• 2. Proinsulin의 발현...27
• 제3절 융합 단백질의 정제...27
• 1. Cell extract의 제조...32
• 2. Column chromatography를 이용한 inclusion body 의 정제...32
• 1) DEAE-Sephacel anion-exchange chromatography...32
• 2) Sepharose-6B gel filtration chromatography...36
• 3) DEAE-Sepharose Cl/6B column chromatography...36
• 3. Urea를 이용한 Solubilization (용해)...41
• 제4장 시안화 브롬의 처리 및 각 사슬의 정제...43
• 1. 반응의 조건...43
• 2. 각 사슬의 정제...46
• 제5장 Sulfitolysis...49
• 제6장 인슈린의 재조합...53
• 제1절 이론적 배경...53
• 제2절 실험방법...55
• 제7장 결론...58
• 제8장 참고문헌...60