보고서 정보
주관연구기관 |
한국과학기술연구원 Korea Institute Of Science and Technology |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2000-10 |
주관부처 |
과학기술부 Ministry of Science and Technology |
등록번호 |
TRKO200200052586 |
DB 구축일자 |
2013-04-18
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초록
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Ⅰ. 제 목 식물 생리활성물질의 탐색과 이용개발 Ⅱ. 연구개발의 목적 및 필요성 21세기에는 인구증가와 농경지의 사막화는 식량사정의 악화에 의해 세계적으로 심각한 문제를 일으킬 수 있다. 냉해 및 건조와 같은 환경스트레스를 극복하기 위한 새로운 농업기술의 개발과 작물보호기술을 개발하기 위해서는 식물호르몬의 기능을 이해해야만 한다. 식물 호르몬은 발아, 성장 개화, 결실에 이르기까지 식물생활환의 전과정을 제어하고 있다. 그러나, 식물 호르몬의 작용기능은 매우 복잡한 연결 망으로 구성되어 있기 때문에 식물호르몬의 기능을 이해하는
Ⅰ. 제 목 식물 생리활성물질의 탐색과 이용개발 Ⅱ. 연구개발의 목적 및 필요성 21세기에는 인구증가와 농경지의 사막화는 식량사정의 악화에 의해 세계적으로 심각한 문제를 일으킬 수 있다. 냉해 및 건조와 같은 환경스트레스를 극복하기 위한 새로운 농업기술의 개발과 작물보호기술을 개발하기 위해서는 식물호르몬의 기능을 이해해야만 한다. 식물 호르몬은 발아, 성장 개화, 결실에 이르기까지 식물생활환의 전과정을 제어하고 있다. 그러나, 식물 호르몬의 작용기능은 매우 복잡한 연결 망으로 구성되어 있기 때문에 식물호르몬의 기능을 이해하는 것은 어렵다. 만약에 합성한 화학분자프로브를 사용해 지베레린 (GA), 아브시스산 (ABA), 브라시노라이드 (BL)과 같은 호르몬의 기능해석이 가능하다면, 이것은 식물 제어기술의 구축에 크게 기여하게 될 것이다. 식물에 있어서 건조, 염, 냉해와 같은 환경 스트레스에 대응하는 분자 메카니즘을 해명하는 것은 환경적응 작물을 개발하는 첫 단계이다. 최근에 생물산업의 발전을 위한 형질전환 식물의 출현은 식량부족문제를 해결할 수 있는 한가지의 방법으로 각광받고 있다. 그러나 식물에 있어서 호르몬의 생리적 효과에 대해서는 잘 알려져 있지만 분자수준에서 호르몬의 신호 인식에 관련된 수용체는 아직 확인되지 않았다. 그러므로 호르몬의 신호전달 과정을 더욱 분명히 이해하기 위해서 생분자 인식프로브의 합성과 호르몬의 신호전달을 해명하기 위한 스크리닝 방법을 설계하였다. Ⅲ. 연구개발의 내용 및 범위 아브시스산 (ABA)은 낙옆의 탈리촉진, 휴면유도, 뿌리의 생육억제, 기공폐쇄 등과 같은 다양한 생리기능을 갖고 식물을 제어하고 있다. 그리고, ABA는 환경 스트레스에 대응하는 역할을 수행하고 있다고 생각되어져 이 분야의 연구에 관심이 집중되어졌다. 식물생리학분야에서 ABA의 역할은 잘 알려져 있으나 ABA의 수용체에 대한 ABA의 작용기능에 대해서는 알려지지않고 있다. 특이적인 생리활성을 갖는 식물생장조절물질을 개발하는 것과 마찬가지로 ABA 결합단백질을 탐색하기 위한 분자프로브의 개발을 위해서는 ABA의 생리활성에 영향을 주지 않는 ABA분자의 변환위치를 찾아내는 것이 중요하다. 세포수준에서 식물호르몬의 인식부위를 연구하는 것은 호르몬 수용체를 단리·동정하는데 본질적인 과정에 속한다. 보리의 호분층 (aleurone layer) 세포는 지베레린과 아브시스산 같은 식물호르몬이 세포에 응답하는 과정을 연구하기 위한 이상적인 생물시험재료를 제공해주고 있다. 호분층 세포를 이용한 제베레린과 아브시스산의 인식 수용체 연구는 많이 진행되어 왔으나 식물로부터 지베레린 혹은 아브시스산의 수용체는 동정되지 않았다. 형광물질이 표식된 생리활성물질은 수용제의 동정 및 기능해석을 위해 널리 사용되어지고 있다. ABA의 작용을 세포수준에서 해석할 수 있는 방법으로 세포벽을 제거한 protoolast를 정제할 수 있으면 다양한 활성검정 기술의 확보가 가능하다고 판단하여 보리종자로부터 protoplast의 정제기술을 확보하고자 하였다. ABA는 식물체가 스트레스를 받을 경우 축적되는 호르몬으로 정보전달 과정에서 지베레린과 밀접한 상보성을 유지하면서 기능을 발휘하는 것이 알려져 있다. 최근에 스트레스를 받은 식물체는 purine과 함께 탈수에 관여하는 단백질인 dehydrin이 유도되는 것이 밝혀져 정제된 protoplast로부터 dehydrin 유도활성기술을 확보하고자 하였다. 한편, 최근에 분자생물학적 방법에 의한 다양한 돌연변이체가 출현하였으며, 이들의 기능해석을 통해 중요하게 식물의 성장과 발달에 관여하는 것으로 인식되어진 브라시노라이드의 기능해석은 식물학 연구의 중요한 과제로 대두되었다. 따라서 본 연구에서는 화학적 방법에 의한 호르몬 연구의 경험을 바탕으로 브라시노라이드 생합성 억제제의 도출과 이러한 생합성 억제제가 지니는 특성을 해석함으로 식물 생장에서의 호르몬의 작용기구의 해석이 가능하다고 생각하였다. 따라서 신규 생합성억제제의 생물검정법의 확립 및 특이적 기능을 발휘하는??자프로브의 합성을 수행하였다. 합성한 화합물로는 ABA의 4'위치에 methoxy기를 치환시킨 4'-methoxy-ABA 및 그의 유도체를 합성하였다. Methoxy-ABA는 ABA의 대사경로 혹은 생합성 과정 중에 생성되는 4'-hydroxy-ABA의 기능을 해석하는데 중요한 화합물로 cress의 발아억제 활성은 ABA와 동등한 활성을 지니고 있으며, α-amylase유도억제 활성은 ABA의 1/4수준으로 약간 미약한 활성을 지니고 있다. Dehydrin 유도 활성은 ABA의 1/10수준으로 나타나 ABA와 같은 생리활성을 발현하는 것으로 판단되어진다. 세포수준에서 ABA의 거동해석을 위한 연구방법의 일환으로 ABA에 형광물질을 도입한 화합물로 FITC-ABA를 합성하였다. 이 화합물은 ABA와 같은 생리활성을 갖는 것으로부터 세포수준에서 ABA의 인식 수용체 탐색 및 ABA의 인식 부위의 해석에 필요한 정보를 얻을 수 화학적 분자프로브의 개발 가능성을 발견한데 그 의의가 큰 것으로 판단된다. 선택적으로 지베레린에 의해 유도되는 α-amylase의 생합성 및 분비를 억제할 수 있는 화합물의 개발은 생화학적, 생리적으로 중요한 의미를 갖게된다. 본 연구에서는 ABA 이외의 화합물로 지베레린의 작용기구를 해석할 수 있는 화합물의 합성을 상정하였으며 우선적으로 triazole계 화합물을 합성하여 α-amylase유도 저해활성과 dehydrin유도활성을 검정한 결과 선택적으로 α-amylase유도 저해활성을 갖는 화합물을 발견하였다. 향후, 이 분야의 연구를 구체적으로 수행할 경우 종자의 발아과정에서 지베레린의 역할을 해석할 수 있는 화학적 분자프로브의 개발이 가능한 것으로 생각되어진다. 세포수준에서 생물활성을 검정할 수 있는 방법으로 보리종자의 호분층에서 추출하여 정제한 protoplast는 생체내에서 호르몬의 작용을 해석하는 중요한 재료로 사용되어지고 있다. 본 연구에서는 새로운 호르몬 기능의 해석을 위해 protoplast의 정제방법을 확립하였으며, 정제된 protoplast를 이용해 지베레린에 의해 유도되는 α-amylase 유도저해활성을 검정하는 방법을 확립하였고, protoplast에 GUS promotor를 도입하는 방법으로 dehydrin 단백질의 활성측정법을 확립하게 되었다. 이러한 활성검정방법의 확립은 ABA 및 지베레린의 상호작용의 해석에 커다란 진전을 이룩할 수 있으며, 세포수준에서 호르몬의 이동 혹은 결합부위를 간접적으로 해석할 수 있는 방법론을 제시할 수 있게 된다. 앞에서 언급한 FITC-ABA와 같이 특정 표식물을 도입한 화합물을 이용해 호르몬의 수용체의 존재위치를 파악할 수 있는 새로운 방법론을 제시한 것이 본 과제의 특징이다. ABA의 신호 전달 경로를 탐색하기 위해 ABA에 의해 유도되는 dehydrin 단백질 유도활성을 검정하였다. 이 결과 Ca2+ channel, PI 3-kinase, phosphatase 및 protein kinase C 등이 ABA의 신호전달에 관여하고 있을 가능성이 시사되었다. 지금까지의 연구결과로는 ABA의 신호전달 경로에는 MAP kinase, Protein phosphatase가 관여하는 것으로 생각하고 있었으나 본 연구 결과로부터 PI 3-kinase, protein kinase C도 ABA의 신호전달 경로에 관여하고 있다는 사실을 발견한 것은 큰 의미를 지닌 연구 결과로 생각된다. 향후 protoplast를 이용한 호르몬의 신호전달 경로에 대한 보다 명확한 해석을 위해서는 보다 구체적인 연구의 수행이 필요하다. 최근 브라시노라이드가 식물 호르몬으로서 식물 성장의 전반적인 과정에 영향을 미치고 있음이 밝혀졌으나 이러한 사실을 식물개체의 모두에게 적용하는데는 어려움이 있었다. 이들의 작용기능을 해석하는데 유용하다고 판단되어지는 특이적인 브라시노라이드의 생합성 억제기능을 갖는 화합물을 합성하였다. 이들 화합물의 활성검정 방법으로는 벼의 제2엽초신장억제 활성, arabidopsis의 배축신장억제 활성, arabidopsis에서 생합성 결손 돌연변이체와의 생리·생태적 특징의 비교 등의 방법으로 새로운 스크링방법을 설정하였다. 합성한 화합물에 의해 나타내는 왜화작용이 다른 식물호르몬과의 상호작용에 대하여 검토한 결과 브라시노라이드 이외의 호르몬인 지제레린, 오옥신, ABA, cytokinin등에서는 응답하지 않는 것이 확인되어 합성화합물이 선택적인 브라시노라이드 생합성 억제제인 것을 확인하였다. 본 연구 결과로 얻어진 브라시노라이드 생합성 억제제로부터 새로운 생리활성 검정방법의 확립 및 신규 식물호르몬인 브라시노라이드의 생리적 특징을 이해함으로 호르몬의 작용기구 해석 및 화합물을 이용한 생합성 경로의 해석이 용이하게 되었다. 이러한 연구 결과는 세계의 식물호르몬 연구 분야에서 주목을 받게 되었으며 상대국 공동연구기관에서도 본 연구과제를 중심연구과제로 상정하여 지속적인 연구가 수행되고 있는 중이다. Ⅴ. 연구개발결과의 활용계획 본 연구 결과 얻어진 기능성 프로브의 합성기술은 생물체가 갖는 다양한 기능의 해석을 위한 저분자프로브의 설계 및 생리적 기능을 해석하는 방법으로 유용하게 사용되어질 수 있다고 생각되어진다. ABA를 중심으로 한 기능성분자프로브의 설계에 있어서 본 연구에서 습득한 기술을 적용할 경우 한층 효율적으로 수행이 가능할 것으로 생각되어진다. 또한 세포수준에서 지베레린 혹은 ABA의 수용체를 해석하는 방법을 정립할 수 있으므로 생합리적인 분자설계에 의한 호르몬 수용체의 해석을 위한 기능성 분자의 합성에 이용될 수 있다. 호르몬의 신호전달 경로의 해석은 아직 미진한 부분이 많이 있어 이들의 작용기구를 해석하는 분자프로브의 합성기술은 학문적 연구를 진일보시킬 수 있는 중요한 재료로 판단되어진다. 또한, 기능성 화합물의 생물활성검정법의 확립은 대단히 중요한 기술로서 보리의 호분층으로부터 추출한 protoplast는 ABA 및 지베레린을 비롯한 다양한 호르몬의 작용기구의 해석을 위한 중요한 재료로 사용될 수 있는 것을 확인하였다. 앞으로 protoplast를 이용한 식물의 기능해석 및 신호전달 경로의 해석을 위한 재료로 충분히 이용 가능한 것으로 생각된다. 브라시노라이드 생합성 억제제를 비롯한 합성화합물은 다양한 생리기능을 해석하는데 중요한 도구로 이용될 가능성이 예상된다. 한·일 양국간의 공동연구로서 추진되어진 이상의 연구 내용을 보다 효율적으로 수행하기 위해서는 한일 양국간의 긴밀한 연구협조가 계속되어야 할 것이다.
Abstract
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I. Title The Search and Development for Utilization of Bioactive Substances of Plants. II. Objectives and Significance of research The increase in population and desertization of farmland can cause a serious worldwide problems by aggravation of the food situation in the 21th century. To overcome
I. Title The Search and Development for Utilization of Bioactive Substances of Plants. II. Objectives and Significance of research The increase in population and desertization of farmland can cause a serious worldwide problems by aggravation of the food situation in the 21th century. To overcome the environmental stresses such as the cold and drought, plant hormone function must be understood for the development of newly agricultural techniques and of crop protection. The plant hormones play an essential role on the growth and developmental stages of plants such as germination, stem elongation, flowering and fruition. However, it is very difficult to understand the function of plant hormones, because they act very complicated through the network. If it is possible to elucidate the plant hormones such as gibberellin, abscisic acid and brassinolide by synthetic molecular probe, it will largely contribute to construct the plant control techniques. The first step to develop environmentally tolerant food crops will be the elucidation of molecular mechanisms by which plants respond to environmental stress elicited by an arid climate, salt, and the cold. Recently, emergence of genomic plants in bio-industry has been spot-lighted as a solution of the food shortage. Despite the wealth of knowledge of hormone on the physiological effects on plants, the components of signal perception on a molecular level have not yet identified. Therefore, to clearly comprehend hormonal signaling, we designed and synthesize the biomolecular recognition probe and developed a novel screen method for hormone signal perception. III. Contents and scope of research Abscisic acid (ABA) controls the acceleration of abscission, induction of domancy, inhibition of rooting, and stimulation of stomatal closurein plants. ABA has been attracted considerable attention, because it has been thought to play an important role to response to environmental stresses in plants. Although the roles of ABA in plant physiology has been well understood, the function of ABA on its receptors has not been understood. To develop probes for ABA-binding proteins, as well as to develop plant growth regulators targeted towards specific biological activities, it is important to identify regions of the ABA molecules that can be modified without affecting its biological activity. It is essential to investigate the perceiving site of plant hormones at the cellular level for isolating and identifying receptors. Aleurone layer cell of wheat provides an ideal biological system to study how cells respond to such plant hormones such as gibberellin (GA) and ABA. Although perception of in aleurone cells has been intensively investigated, the investigation of GA or ABA receptorin plants has not yet identified. Fluorescence-labeled bioactive compounds has been widely used to identify and analyze the function of receptors, and these compounds make it possible to observe the binding between chemicals and cognate receptors in a real-time mode. The application of many biologically active brassinosteroid (BR) homologs has been shown to cause remarkable growth responses such as stem elongation, cell elongation, pollen tube growth, leaf bending, root inhibition, proton pump activation, promotion of ethylene production in plants. The use of specific bio-synthetic inhibitors is an alternative way to determine the physiological functions of endogenous substances. Therefore, a study of specific inhibitors in bio-synthesis could provide a new approach to understand the functions of brassinosteroids. IV. Results of research We investigated about ABA receptor by synthesizing the molecular probe. We prepared new compounds by introducing a 4'-methoxy group in place of 4'-carbonyl group in ABA as molecular probes to investigate ABA-binding proteins in barley aleurone cells. 4'-Methoxy-ABA is an important compound to interpret the function of 4'-hydroxy-ABA which is produced during course of the bio-synthesis or metabolism. The activity of 4'-Methoxy-ABA showed similar to ABA to inhibit cress germination, but showed a fourth activity to inhibit GA-inducible α-amylase. 4'-Methoxy-ABA has ABA-like activity in various biological responses. To interpret the function of ABA in molecular level, FITC-ABA which contains fluorescent substance was prepared, which showed the similar activity to ABA, and found to be a valuable chemical molecular probe to interpret the perceving cite. To evaluate the activity of ABA analogs, the aleurone layer of barley was chosen as a unique and highly suitable system, because the ABA-regulated gene expression and enzyme synthesis can be accurately assayed at the very low level of endogeneous ABA. To study the direct interaction between fluorescence-labled ABA (FITC-ABA) and the receptor, we established protoplast isolation method from aleurone cell to investigate binding affinity on ABA receptor. ABA has been known to mediate rapid physiological responses to water stress such as stomatical closure and to be involved in dehydrin synthesis. The screening method for the dehydrin gene expression was settled in aleurone protoplast by measuring dehydrin promoter activity. Specific inhibitors of biosynthesis are quite effective to determine the physiological functions of endogenous substances. Therefore, a specific inhibitors of brassinosteroid biosynthesis could provide a new approach to understand the functions of brassinosteroids. Screening for brassinosteroid biosynthesis inhibitors was performed to find chemicals that induce dwarfism in Arabidopsis, mutants that resembled brassinosteroid biosynthesis mutants that can be rescued by brassinolide. The compound brassinazole was selected as the most potent chemical through the screening experiment. V. Application of research and recommendations The design and synthetic methods developed by us for functional biomolecular probe will contribute for the search of receptor binding site in cellular level. Therefore, we will try to use these compounds to chemical probe for the search of ABA receptor. Isolated protoplast from barley aleurone layer provided GA-induced α-amylase inhibition and ABA-dependent dehydrin induction assay for the evaluation of biological activity on the synthetic compounds, and then it could be applied to elucidation of hormonal signal transduction in cellular level. Fluorescence-labled molecular probe provides important information to study signal transduction mechanisms, including Ca2+ regulation and the activities of other second messengers. The first brassinosteroid biosynthesis inhibitors were synthesized. Those inhibitors (Brz: brassinazole) will provide new approach to determine the physiological functions of brassinolide and to examine the putative target sites of chemical in plants. Therefore, we will try to use these compound to plant growth regulator and search of chemical knock-out mutant. The project is required to be continued on the bases of close co-operation between Korea and Japan for the more successful accomplishment of the research and utilization for bio-active substances of plants.
목차 Contents
- 제 1 장 서론...12
- 제 2 장 국내외 기술개발 현황...15
- 제 1 절 식물호르몬의 상호작용...15
- 제 2 절 국내의 기술개발현황...18
- 제 3 절 국외의 기술개발현황...20
- 제 3 장 연구개발 수행내용 및 결과...24
- 제 1 절 Abscisic acid 유도체의 합성...24
- 제 2 절 보리 호분층의 proroplast 정제...33
- 제 3 절 Abscisic acid 유도체의 생리활성...47
- 제 4 절 - Amylase 생합성 억제제의 분자설계 및 합성...58
- 제 5 절 Brassinolide 생합성 억제제의 분자설계 및 합성...73
- 제 6절 실 험...123
- 제 4 장 연구개발 목표달성도...146
- 제 5 장 연구개발결과의 활용계획...153
- 제 6 장 참고문헌...155
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