초록 ▼

1. 연구내용
본 연구에서는 최근에 동물생약으로 사용되고 있는 사람태반, 소태반, 소비장, 말비장을 중심으로 이를 대용할 가능성이 높은 동물 종들, 즉 사람, 소, 말, 돼지 동의 동물 장기들 (비장, 신장, 심장, 간장, 태반 등)을 이화학적 및 조직학적 방법을 이용하여 동물장기제제의 이화학적 규격 및 품질관리법 기준을 확립한다. 또한, 각 동물의 mitochondrial DNA (mt. DNA) 에 대한 종특이적 PCR법, PCR-RFLP법, 및 염기서열분석과 더불어 각 장기들에 대한 면역확산법과 종특이단백질검출을 위한 W

1. 연구내용
본 연구에서는 최근에 동물생약으로 사용되고 있는 사람태반, 소태반, 소비장, 말비장을 중심으로 이를 대용할 가능성이 높은 동물 종들, 즉 사람, 소, 말, 돼지 동의 동물 장기들 (비장, 신장, 심장, 간장, 태반 등)을 이화학적 및 조직학적 방법을 이용하여 동물장기제제의 이화학적 규격 및 품질관리법 기준을 확립한다. 또한, 각 동물의 mitochondrial DNA (mt. DNA) 에 대한 종특이적 PCR법, PCR-RFLP법, 및 염기서열분석과 더불어 각 장기들에 대한 면역확산법과 종특이단백질검출을 위한 Western blotting법 등의 최신의 분자생물학적 방법을 응용함으로써 동물의 유사장지를 보다 더 과학적으로 감별할 수 있는 방법을 개발하여 실제에 적용함으로써 동물장기를 이용한 불법적인 생약재료의 혼용을 방지하고, 최종적으로 동물장기제제의 규격 및 품질관리기준을 확립함으로써 동물장기재료 및 생약제제의 품질평가법을 확립하고자 하였다.
2. 연구방법
1) 사람과 동물의 혈액, 조직, 및 장기로부터 생약원료의 구엽 또는 입수
본 연구에 사용될 예정인 동물생약원료는 우선 과제에서 제시하는 사람태반과 소비장을 포함하여 이와 색깔, 또는 경도상(단단한 정도)으로 유사하여 혼입이 예상되는 장기 (신장, 심장, 간장 등)와 혈액 및 조적의 샘플을 포함하도록 한다. 또한 소비장과 유사한 말비장 이외에 심장, 신장과 같은 색조가 유사하고 도축장이나 국내에서 쉽게 구매가 가능하여 혼입이 예상이 되는 말과 소의 각종 장기이외에 사슴이나 염소 (산양) 등의 장기도 구입 또는 국내외 출장올 통하여 연차적으로 입수하였다(일부 동물의 DNA는 연차적 계획에 따라서 실시할 예정에 있다.). 소태반을 적출하여 표준품을 제조하며, 사람태반은 충북대학교 병원 (환경부 금강환경관리청의 폐기물관리법 제 12조에 의거하여 감염성 폐기물의 사전사용승인을 취득한 후 적법한 절차에 따라 샘플을 입수하였음)을 통하여 신선하고 오염되지 않은 태반조직을 입수하였다. 입수된 동물장기 또는 사람의 장기는 장부에 기록후 조직학적 검사할 장기 이외에는 모두 액체질소에 담그어 신속하게 냉동시킨 후 냉동보관하였다. 동결건조조직의 샘플은 냉동동결건조기 (FD551O PT, Ilshin Lab. Co., Seoul)를 이용하여 약 10 mTorr, 냉동실 -55${^{\circ}C}$, 건조실 40${^{\circ}C}$ 조건의 챔버내에서 2일내지 3일간 냉동동결건조를 실시하려 이화학적 검사 및 표준품으로 사용하였다.
2) 동물장기제제의 이화학적 규격 및 품질관리법 기준 확립
각 동물장기에 대하여 기초적인 단백질, 지방질, 회분 (탄수화물 및 무기질성분) 등의 이화학적 함유량 등에 대하여 ICP/AES 기기(Inductively coupled plasma spectrophotometer/Automic emission spectrophotomer (LABTAM 8440, Australia)를 이용하여 조사 · 분석하여 한국화학시험연구원에 시험을 의뢰하여 단백질, 지방질, 회분함량, Na, K, P 등의 무기염류 및 철, 칼슘 등의 미량중금속 등에 대하여 식약청고시 또는 일반적인 분석방법에 준하여 이화학적 검사를 실시하였다. 또한 동물장기의 육안 특성을 조사하고 동물장기의 정상적인 조직표본을 만들어 원료단계에서 육안 및 조직학적 분석을 통한 감별법을 기술하였다. 동물 장기 및 사람 태반에 대한 조직학적 연구를 병행함으로써 동월장기의 조직특성을 기술하였다.
3) 동물장기유래의 생약표준품 제조 및 동물장기 원료의 품질평가법 확립
동물장기 원료는 동결건조과정을 거쳐서 사람태반과 소태반의 표준품을 제조하였다. 또한, 소, 돼지 등 말과 유사한 가축의 비장을 포함한 장기별 냉동동결표준품을 제조하여 동물장기 원료를 육안 및 관능적으로 비교 분석할 수 있는 자료로 제시하였다.
4) 각종 동물의 mitochondrial DNA분석을 통한 동물종간 감별법의 확립
Mitochondria DNA (mt. DNA)를 대상으로 각종 동물들의 종간 비교분석 연구를 하는데 이용되는 다음의 접근 방법은 생약 원료로 이용되고 있는 동물 장기의 식별에도 유용하게 이용된다.
(1) 시료로부터 DNA의 분리
사람, 소, 돼지, 말 등의 조사 대상 동물들의 혈액의 경우 0.5M EDTA가 함유된 시험관에 혈액을 채취하며 태반 비장 등의 장기와 조직의 경우는 도축장 또는 병원에서 입수하였다. 혈액으로부터의 DNA분리는 먼저 백혈구층을 분리하고 0.2% NaCl용액으로 용혈시킨 후 lysis buffer (50mM Tris-HCl, pH 8.0, 50mM EDTA, 0.5% SDS, lOmM Nacl) 그리고 proteinase K (10 mg/ml)를 처리하여 DNA를 용출시킨다. 조직 및 생약 원료의 경우 각 동물에서 채집한 태반과 비장 및 생약 원료 O.2g을 추출용액 (20mM Tris, pH 8.0, O.1M NaCl, 1.5mM $MgCl_2$)으로 3 회 세척한 후, 5ml의 10% SDS 용액을 첨가하고, 여기에 O.lml의 proteinase K용액올 섞어 40${^{\circ}C}$ 에서 20시간 가볍게 진탕하며 반응시켜 단백질을 분해하였다. 반응액은 TE용액으로 포화시킨 phenol액 5ml로 1회, phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)액 5ml로 1회, 그리고 chloroform 5ml로 1회 추출하여 단백질을 제거하였다. 회수한 수층에 O.1ml RNase A용액을 가한 후 40${^{\circ}C}$ 에서 30분 반응시켜 RNA를 분해한 후, TE용액으로 포화시킨 phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25: 24: 1)액 5ml과 chloroform 5ml로 각 1회씩 추출하여 RNase A를 제거하였다. 회수된 수층은 다시 원심분리하여 농축한 후, 2ml TE용액을 가한 다음 다시 원심분리하여 염을 제거하였다. 남은 용액을 모아 전체량이 1ml가 되도록 TE용액을 가하여 희석후 증폭용 유전자로 사용하였다.
(2) 종 특이적 mitochondria DNA 증폭용 primer의 선발 및 PCR분석
각 동물 종마다 특이적 mitochondria DNA의 중폭 primer를 선발하기 위해서는 본 연구에서 선정된 각 동물들 즉, 사람, 소, 말, 돼지의 mitochondria DNA에 대한 유전체 분석이 선행되었다. GeneBank (National Center for Biotechnology Information, NIH, USA) 에 등록된 대상 동물들의 mitochondria DNA 전체 염기서열을 확보하여 이들의 유사성과 상이성을 비교한 후 각 동물 종을 구별할 수 있는 적절한 primer를 선발하였다. 특히, 각 동물들의 D-loop region의 비교 분석을 통해 가장 적합한 primer릎 선별한 다음 PCR을 통해 이들의 크기 및 특징을 관찰하였다.
(3) Mitochondria DNA의 부분 염기서열 분석
PCR에 의해 장기간 구별이 되지 않을 경우 구체적으로 어느 염기가 달라짐으로써 제한효소 단편이 다르게 나오는가를 알아야 하므로 mitochondria DNA의 PCR 산물을 cloning 하여 염기서열 분석을 수행하였다. Agarose gel상에서 전기영동으로 확인된 PCR 산물을 gel상에서 면도칼 등으로 잘라낸 후 DNA정제 kit에 의해 DNA단편을 추출하였다. 그 후 Promega사에서 구입한 pGEM T-vector와 ligation시키고, heat shock방법으로 대장균에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균 (E. coli) 숙주는 LB plate에 도말후 white colony흘 선별하였다. 그 후 바람직한 insert의 조사를 위해 colony PCR과 제한효소로 처리하여 목적의 insert DNA를 가지는 colony를 선별한다. 그후 5㎖의 LB medium (50μg/㎖ ampicillin)에서 선별된 대장균을 배양하여 alkaline lysis법으로 plasmid를 분리한 다음 자동염기서열분석기률 이용하여 염기서열을 결정하였다 (마크로젠, 서울에 의뢰하여 분석하였다).
(4) Mitochondria DNA의 PCR-RFLP 분석
Mitochondria DNA의 RFLP 분석은 종간 뿐만 아니라, 종내에서 각 동물의 유연관계를 비교 분석을 하는데 유용한 실험 방법이다(Krieg et al., 2000). 특히 미지의 종을 신뢰성 있게 구별할 수 있는 방법으로 PCR-RFLP 방법이 이용되고 있다(Wolf et al., 1999). 본 연구에서는 Cytochrome b region등의 단백질 암호부위를 각 동물종에 공통적으로 적용될 수 있는 PCR primer를 선발한 후, 이를 이용해 mitochondria DNA (mt. DNA)를 증폭시켰다. 증폭된 PCR 산물은 subcloning을 하여 염기서열분석을 실시 하였다. 염기서열 분석결과에 따랴서 적당한 제한효소를 사용하여 PCR 산물을 처리한 다음 2-3% agarose gel에서 전기영동을 수행하였다. 생약제제와 같이 불안정한 DNA의 경우 DNA가 많이 파괴되어 있을 것으로 생각되어, 작은 크기의 mitochondria DNA를 증폭할 수 있는 primer set을 개발하였다.

Abstract ▼

Animal crude drugs (natural medicines derived from animal organs) have been widely used in various Chinese medicines and medicines for the therapeutic agents or the enhancing immunologic functions. However, there are few studies evaluating the constituents of these drugs as compared to studies on pl

Animal crude drugs (natural medicines derived from animal organs) have been widely used in various Chinese medicines and medicines for the therapeutic agents or the enhancing immunologic functions. However, there are few studies evaluating the constituents of these drugs as compared to studies on plant crude drugs. It is very important to quantify and/or qualify the contents of the constituents of animal crude drugs from the viewpoint of quality control. We have been examined the safety and the evaluation methods of the animal crude drugs including human placenta. We are investigated the several methods including the physico-chemical analysis, histological examination, and polymerase chain reaction (PCR) and PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) analysis for the mitochondrial DNA (m. DNA) of the animal organs/tissues as well as the placenta of the humans. The capsules and trabeculae of the horse and cow spleen contain many smooth muscle cells and are thicker than those of pig. The histologic findings of the other organs are very similar to each organ. A method for identification of game species has been developed on the basis of the amplification of specific part of the mt. DNA genome using the PCR. The analysis of RFLP of the PCR fragments was already successfully applied for species differentiation. PCR-RFLP of different genes was demonstrated to detect inter- and intra-specific variations in several animals such as cow, horse, pig, and humans. Species-specific PCR banding of D-loop mt. DNA the horse (equine), cow (bovine), pig (pork), and humans are 133 bp, 137bp, 231 bp, and 240 bp, respectively. The pork tissues were identified using restriction enzyme, HphI cut into the two subfragments, 36 bp and 195 bp banding in the heart, spleen, liver except for kidney (231 bp). The pork tissues were identified using restriction enzyme, SpeI cut into the two subfragments, 84 bp and 147 bp banding in the heart and liver except for kidney and spleen (231 bp). The bovine tissues can be cut into 68 bp and 69 bp banding in the liver, kidney, and spleen using. NalIV except heart and placenta (137 bp). In placenta, the bovine and humans can be easily identify using each primer. And therefore each primer of human and bovine placenta will be available to identify placenta-specific in their own species.
Our results suggest that PCR-RFLP of different genes was demonstrated to detect inter- and intra-specific variations in the cow, horse, pig, and humans and inter-organ specific variation will be possible in the near future. We hope that these method will be applicable to identify the origin of the samples of animal-derived crude drugs.

목차 Contents

• 표지...1
• 용역연구개발사업 최종보고서...3
• 제출문...5
• 요약문...7
• SUMMARY...20
• 목차...21
• 제1장 서론...23
• 1. 연구배경...23
• 2. 연차별 연구개발목표...25
• 3. 연구목적...25
• 제2장 국내.외 기술개발 현황...26
• 1. 국내.외 연구동향...26
• 2. 국내.외 정책동향...27
• 3. 동물장기 및 사람 장기의 재활용을 위한 법적 장치의 미흡...27
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과...29
• 1. 연구 내용...29
• 2. 연구 방법...30
• 1) 사람과 동물의 혈액, 조직 및 장기로부터 생약원료의 구입 또는 입수...30
• 2) 동물장기체제의 이화학적 규격 및 품질 관리법 기준 확립...30
• 3) 동물장기유래의 생약표준품제조 및 동물장기원료의 품질평가법 확립...30
• 4) 각종 동물의 mitocondrial DNA분석을 통한 동물 종간 감별법 확립...31
• 5) 동물간 종 특이 단백질 분석을 통한 동물 종 감별법과 정량분석...33
• 3. 연구결과...34
• 1) 동물별 및 장기별 육안 및 조직학적 검사결과...34
• 2) 동물장기별 이화학적 검사결과...41
• 3) 동물 및 장기별 mitocondrial DNA의 PCR-RFLP 결과...47
• 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도...54
• 1. 연구개발목표 달성도 및 활용계획...54
• 2. 대외기여도 및 향후추진계획...54
• 3. 정책대안제시...55
• 제5장 연구개발결과의 활용성과 및 계획...56
• 1. 계량적 성과...56
• 2. 성과내용기술...56
• 3. 활용계획...56
• 4. 향후추진계획...56
• 제6장 기타 중요변경사항...57
• 제7장 참고문헌...58
• 연구과제(세부과제) 요약서...60