초록 ▼

본 실험에서는 가능한 한 stem cell을 분리하는 효율적인 방법과 chitosan과 collagen의 장점을 공유할 수 있는 혼합 진피 구조물의 제조 기술을 개발하고, 진피 구조물에 성장인자 및 세포외 간물질로 구성된 상처 치유 촉진 환경의 재조합 기술을 개발하며(type I BAS), type IBAS에 인체 섬유아세포를 3 차원적으로 공동 배양한 type II BAS 제조 기술을 개발하여 동물모델에서 type I-II BAS의 상처 치유 효과 평가를 통해 화상, 난치성 궤양, 외상 등에 임상 적용이 가능한 생인공 피부의 임상

본 실험에서는 가능한 한 stem cell을 분리하는 효율적인 방법과 chitosan과 collagen의 장점을 공유할 수 있는 혼합 진피 구조물의 제조 기술을 개발하고, 진피 구조물에 성장인자 및 세포외 간물질로 구성된 상처 치유 촉진 환경의 재조합 기술을 개발하며(type I BAS), type IBAS에 인체 섬유아세포를 3 차원적으로 공동 배양한 type II BAS 제조 기술을 개발하여 동물모델에서 type I-II BAS의 상처 치유 효과 평가를 통해 화상, 난치성 궤양, 외상 등에 임상 적용이 가능한 생인공 피부의 임상적용 가능성을 평가하고자 한다 먼저, 충분한 porosity와 구조적 안정성을 보유한 진피구조물의 제조하기 위해 중화 chitosan 용액을 porogen으로 물을 이용하여 동결 온도를 조절하여 dermal scaffold를 제조한다. Chitosan sponge의 세포부착력을 증진시키기 위해 collagen 또는 bFGF와 fibronectin를 혼합한 액을 적용하여 deep coating 시켜 Type I BAS를 제조하여 scaffold의 구조 및 세포 친화성을 확인하였다Donor site로서의 적합성을 평가하기 위하여 나이 별로 부위별 피부 조직을 취하여 세포분포도 및 진피 thickness, collagen bundle 존재 및 세포밀도 등을 평가하였다. 각 개 대 별로 cell division rate을 분석하고 세포 확장력 및 최적 plating density를 결정하였다. Allogenic dermalfibroblast의 안전성 확보를 위해 확장기간 중 개 대 별로 세포를 취하여 HLA 발현을 FACS로 분석하였다 인체 섬유아세포를 stataic 혹은 dynamic loading법으로 생인공 진피구조물에 loading하여 MTT 분석법을 통해 최적의 기술을 개발하고, Invivo 이식 후 최대 세포 생존률을 주는 최적의 in vitro 배양 기간을 결정하기 위해 nude mice 이식한 후 30일에 생존한 인체 세포를 조직면역화학 염색으로 확인하여 평가하였다 인체 피부조직을 trypsin/EDTA, New method(본 연구실 방법)으로 세포를 분리하고 분리된 세포는 cell counting 후 colony forming assay, Betal integrin FACS 분석, involucrin 형광염색, alpha2 integrin 형광 염색 등으로 stem cell pool 함유 정도를 평가하였다 생쥐와 같은 소동물은 창상 수축을 통하여 상처 치유를 시키는 능력이 아주 크므로 상처 치유와 wound closure을 구별이 어려워 본 연구진은 창상 수축을 배제한 조건에서 상처 치유를 평가하기 위하여 생쥐의 등허리 부위에 splint를 장착하여 창상 수축을 인위적으로 억제하여 비교하였다

Abstract ▼

The purpose of this project is to develop bio artificial skin for the treatment of burn patients. Although up until now there areseveral artificial skin products produced and commercially available, most of them are collagen-based sponge types. Collagen-based bio artificial skin has been limited in

The purpose of this project is to develop bio artificial skin for the treatment of burn patients. Although up until now there areseveral artificial skin products produced and commercially available, most of them are collagen-based sponge types. Collagen-based bio artificial skin has been limited in their usages due to their a very high-cost and lack of rigidity. We have therefore developed dermal scaffold using one of natural polymer, chitosan to solve the above problems. Chitosan-based bio artificial skin we developed is economical, rigid, biodegradable and bio compatible. To develop skin-derived cell-loaded dermal scaffold, ideal bio artificial skin, we also improved in vitro cell processing procedures including primary cell isolation and culture and preconditioning and cell loading techniques onto dermal scaffoldI) The porosity of chitosan scaffold was controlled by verifying temperature of freeze-drying; the optimized condition of open pores of about 80-120㎛ in diameter with even distribution was obtained at -80℃II) We also developed conjugation techniques of chitosan scaffold with various extra cellular matrix and growth factors. Chitosan scaffolds were immersed in solutions containing fibronectin(50-200ng/ml), type I collagen(30-300ng/ml) and bFGF(50-200ng/ml) and freezed dried. Conjugation did not harm scaffold integrity and improved cell adhesion in their scanning electron microscope photographs. These advanced types of bio artificial skin is expected to reconstruct wound healin genvironment more rapidly at grafted sites in their clinical applicationsIII) To obtain healthy and stem cell-enriched keratinocytes, we improved the method to isolate epidermal cell and to enrich stem cellpopulation. The new method utilized magnetic stirring during digestion of the skin with trypsin/EDTA(magnetic stirring method).This magnetic stirring method significantly improved both cell yield and colony forming efficiency(CFE) over the convention alepidermal cell isolation methods, such as Greens, thermolysin or dispase method, about 9 times IV) Dermal fibroblasts were loaded onto chitosan scaffold by dynamic seeding versus static seeding. Media flowing was given throughout the cell seeding and cell culture period using a shaker in dynamic seeding. Histological examination showed that dynamic cell loading improved cell loading(more even and deeper loading) and increased cell growthV) We also developed in vitro preconditioning method of dermal fibroblasts with the application of physical stimuli during cell culture.In the preconditioning method, physical stimulus is generated by vacuum and adjusted in a computerized, pressure-oriented system, Flexercell Strain $Plus^{TM}$ system. Total protein content of the dermal fibroblasts and cell number increased 5 times and fibronectin secretion into culture media increased 283 times after cell preconditioning was provided. Increase in cell growth and ECM secretion by preconditioning was provided. Increase in cell growth and ECM secretion by preconditioning would contribute to improved adaptaion and survival of grafted cellsVI) Wound healing model with loose skin animals such as mouse and rat does not appropriately reflect wound healing processoccurred in human skin, due to their severe skin contraction after wound is generated. In this regard we have developednovel mouse wound healing model, namely 'mouse splint model' in which syringe splint was implanted between the edgeof wound area and muscle fascia, fixed by suture. Implanted syringe splint served as a physical barrier to prevent skincontraction. This model could provide appropriate human equivalent mouse wound healing model, as excluded skincontraction

목차 Contents

• 표지 ...1
• 제출문 ...2
• 요약문 ...3
• Summary ...6
• Contents ...8
• 목차 ...9
• 제1장. 서론...10
• 제2장. 국내외 기술개발 현황...13
• 1. 국내외 연구 및 개발 현황...13
• 2. 시장성격, 규모 및 산업계의 현황...15
• 제3장. 연구개발수행 내용 및 결과...18
• 제1절. 서론...18
• 제2절. 실험적 접근방법...19
• 제3절. 연구내용...21
• 제4절. 연구결과...31
• 제4장. 연구개발목표 달성도 및 대외기여도...68
• 1. 계획대비 달성도...68
• 2. 대외 기여도...69
• 제5장. 연구개발결과의 활용계획...70
• 제6장. 참고문헌...71