본 연구실에서는 상처의 종류 및 목적에 따라 차별화된 생인공피부 개발의 핵심 기술을 개발하여 화상, 재활 성형, 난치성 궤양, 외상 등 치유에 적용하고자 한다. 진피 지지체로서 chitosan/collagen의 장점을 공유한 혼합 진피 구조물에 성장인자 및 세포외 간물질로 구성된 상처 치유 촉진 환경을 재조합한 type I BAS를 개발하고, type I BAS에 인체 섬유아세포를 접종한 type II BAS, type II BAS에 표피세포, melanocyte, 혈관세포를 배양한 완전한 피부형의 type III BAS 기술을 개
본 연구실에서는 상처의 종류 및 목적에 따라 차별화된 생인공피부 개발의 핵심 기술을 개발하여 화상, 재활 성형, 난치성 궤양, 외상 등 치유에 적용하고자 한다. 진피 지지체로서 chitosan/collagen의 장점을 공유한 혼합 진피 구조물에 성장인자 및 세포외 간물질로 구성된 상처 치유 촉진 환경을 재조합한 type I BAS를 개발하고, type I BAS에 인체 섬유아세포를 접종한 type II BAS, type II BAS에 표피세포, melanocyte, 혈관세포를 배양한 완전한 피부형의 type III BAS 기술을 개발하였다. 이 과정에서 생체에 이식한 세포의 생존력 및 적응력 증진을 위한 세포훈련 기술, 효율적인 줄기세포 분리/분화 유도 기술, 교차분화 이용 기술 등을 개발하였고, 이 기술은 장차 다른 표피 조직의 재생은 물론 조직공학 기술 개발에 근간이 되는 핵심기술이 될 것이다. (1) 중화키토산 및 콜라겐의 장점을 공유하고 상처 치유 촉진 인자를 함유한 진피지지체 제조 기술 (2) 인체 표피줄기세포, 색소세포, 진피 섬유아세포의 효율적 분리 및 이용 기술 (3) 이식한 세포의 생존률 및 생체 적응력 증진을 위한 세포 훈련 기술 개발 (4) 인체 피부 조직의 교차분화 유도기술 개발 (5) bioscreening용 생인공피부 기술 개발
Abstract▼
In the present study, we developed various types of bioartificial skin (BAS I-III) applicable for the purpose of severity of skin wounds. First, BAS I is a dermal scaffold, mixture of collagen and chitosan, supplemented with cytokine and extracellular matrix. BAS ll is the more advanced type of bioa
In the present study, we developed various types of bioartificial skin (BAS I-III) applicable for the purpose of severity of skin wounds. First, BAS I is a dermal scaffold, mixture of collagen and chitosan, supplemented with cytokine and extracellular matrix. BAS ll is the more advanced type of bioartificial dermis where human dermal fibroblasts are loaded onto type I BAS. BAS III approximates to the real skin, in that BAS ll is consisted of BAS ll, melanocytes, keratinocytes and endothelial cells. We also developed preconditioning protocol using cell straining system applicable to the in vitro skin cell culture or BAS. Cell preconditions greatly improved production of extracellular matrix and survival of skin cells, In addition, we established a novel cell isolation method to enrich epidermal stem cells, to differentiate keratinocytes to the fully-stratified epithelial layer, to transdifferentiate skin epi, to cornea epithelium and to transdifferentiate dermal cells to the nestin-expressing neural precursors. In summary, (1) Development of dermal scaffold, taking advantages of both chitosan and collagen and providing wound healing microenvironment (2) Efficient isolation and in vitro expansion method of skin-derived cells such as keratinocytes, finbroblasts, melanocytes and microvascular endothelial cells (3) Optimzation of skin cell preconditiong to improve the rates of cell survival and intake on the grafted site (4) Transdifferentiation of skin-derived cells to cornea epithelium and neural precursors (5) Developemnt of BAS for bioscreening
목차 Contents
제1장 연구개발과제의 개요...25
제1절 연구개발의 목표...25
1. 최종 목표...25
2. 단계별 목표...25
제2절 연구개발 개요...26
제3절 연구개발의 필요성...28
1. 연구개발의 경제.사회.기술적 중요성...28
제2장 국내외 기술개발 현황...30
제1절 인공피부 연구 개발 현황 분석...30
제2절 인공 피부의 시장성격, 규모 및 산업계의 현황...33
1. 인공피부 세계 시장...33
2. 국내 현황...34
제3절 성인 줄기세포를 이용한 재생의학의 응용과 발전전망...35
1. 성인 줄기세포의 재생의학에서의 새로운 가능성...35
제3장 연구개발수행 내용 및 결과...37
제1절 Chitosan/collagen의 장점을 보유한 혼합 진피 지지체 제조 공정 기술 개발...37
1. 중화 키토산 지지체의 제조...37
2. Collagen으로 코팅된 키토산 지지체의 제조...38
3. 섬유아세포에 대한 키토산 분해물의 독성시험...39
4. 아세틸화 chitosan scaffold의 제조 및 특성 분석...40
5. 아세틸화 chitosan scaffold에 대한 세포친화도 및 콜라겐 코팅 효과...42
6. 아세틸화 chitosan scaffold의 in vitro 생분해성 실험...43
7. Mouse 피하 이식 실험을 통한 아세틸화 chitosan scaffold의 in vivo 생분해성 실험...44
8. 아세틸화 chitosan scaffold의 in vivo 생체 적합성 실험...45
제2절 진피 지지체에 상처 치유 촉진 환경 (bFGF, fibronectin) 재조합 기술 개발 (BAS I)...62
1. 키토산 진피 지지체에 bFGF, fibronectin, collgen type I 전달 기술 개발 및 진피 섬유아세포의 성장 촉진 효과 분석...62
2. ECM 성분의 코팅에 따른 세포이동성...63
제3절 BAS I에 인체 섬유아세포 접종 및 배양 기술개발 (BAS II)...69
1. type I BAS에 진피 섬유아세포 최적 세포접종 기술 개발...69
제4절 상처 치유 평가용 동물 모델 개발 및 BAS I 전임상 시험...72
1. 상처 치유 평가용 동물 모델 개발 및 치유 기전 규명...72
2. Chitosan scaffold의 in vivo 이식 실험...75
제5절 표피층과 진피층의 결착력 증진을 위한 basement membrane 재건 기술 확립...89
1. Type IV collagen과 laminin으로 구성된 basement membrane 재건...89
2. 섬유아세포에 tension을 제공함으로써 기저막 성분의 합성을 촉진...90
3. BAS III에 compression을 제공하여 피부세포의 결착력 증진...90
제6절 피부에서 인체 표피줄기세포, 섬유아세포, 혈관 내피세포 및 색소 세포의 효율적 분리 및 최적 배양 기술 및 실용화 기술 개발...97
1. 인체 성인 피부 조직에서 효율적 표피 줄기세포 분리 기술 개발...97
2. 색소세포의 분리/초기화 배양/특성 분석...100
3. 신생아 진피 섬유아세포 (동종세포)의 세포치료제로서의 안전성 확인...100
4. 미세혈관 내피세포 분리/초기화 배양...101
제7절 모낭 표피세포 특성 분석 및 모낭 재생 유도 기술 개발...113
1. 모낭세포의 일차 분리, 배양법 수립...113
2. Donor site별 모낭의 해부학적, 생화학적 특성연구...113
3. 고정화된 모낭세포의 피더 제작...115
4. 모낭 분화 기전 연구 및 dermal papillae 재조합 기술 개발...116
5. C57BL/6 mouse의 hair depilation을 이용한 모낭 분화 관련 신호전달 단백질 연구...120
6. 인체 피부 표피세포의 in vitro transfection을 이용한 모낭 분화 관련 신호전달 단백질 연구...121
제8절 표피세포의 계층화/분화 유도 기술 개발...146
1. 표피세포 분열/분화의 기본 메커니즘(PKB를 중심으로)을 이용한 표피세포 분열/분화의 조절법...146
제9절 세포 생존력 및 적응력 증진을 위한 세포 훈련 기술(Cell preconditioning) 개발...149
1. 신장력 제공에 의한 세포수 증가...149
2. Fibroblast의 세포 훈련에 적절한 힘의 범위 설정...151
3. 물리적 자극에 의한 소포 반응기전 규명: Cyclic strain에 의한 초기신호전달체계의 분석...152
4. 세포훈련에 의한 세포부착력 증진 및 생존율, 세포분열 증진효과 평가...154
5. 세포훈련 의한 세포부착력 증진 및 생존율 증진 효과 평가: Shear Streamer TM를 통한 세포 부착력의 표준화 평가법 구축...157
제10절 표피세포/Melanocyte/혈관내피세포의 접종 및 공동배양 수립 조립(BAS III) ...177
1. Type III BAS 제작을 위해 integra scaffold를 이용한 표피세포의 in vitro 접종 방법과 배양법 개발...177
2. Type III BAS 동물시험의 적용 시, rete ridge 형성과 진피층의 세포외 기질 구성 성분 재구성을 촉진시키기 위해 integra scaffold를 이용한 표피세포와 섬유아세포의 in vitro 접종 방법과 배양법 개발...178
3. Type III BAS 동물시험의 적용 시, 색소 문제를 해결하기 위해 integra scaffold를 이용한 표피세포와 멜라닌색소세포의 in vitro 접종 방법과 배양법 개발...179
4. Type III BAS 동물시험의 적용 방법을 수립하기 위하여 표피세포가 배양된 integra scaffold를 이용한 동물실험 수행...179
5. 색소문제 해결을 위한 keratinocyte/melanocyte co-culture 조건 수립...181
제11절 Chitosan fiber를 이용한 혈관재생 유도 기술...208
1. 평활근세포(SMC)의 순수 분리 및 동정...208
2. Chitosan fiber를 이용한 혈관재생...209
3. 혈관내피세포의 transdifferentiation을 최소화할 수 있는 배양 조건 개선...210
4. 효율적인 내피세포 및 평활근세포 분리법 일차 분리법 확립...211
5. 혈관 형성 최적 조건 확립 (세포외간질, 성장인자, 물리적 자극, 세포 접종법) 및 Tube에 혈관 내피세포/평활근세포의 접종법 개발...212
6. 튜브형 하이브리드 scaffold을 이용한 bilayer 혈관 재생 조건 수립하이브리드 scaffold에 적절한 stress 제공 조건 수립...213
제12절 상처치유 촉진 성장 인자 고정화 기술 개발 및 유전자 전달 기술 개발 (BAS IV)...227
1. 상처치유 촉진 성장 인자 고정화 기술...227
2. 성장인자 유전자의 GAM 전달 및 발현 측정...238
제13절 BAS II, III, IV의 전임상 시험...268
1. BAS II, BAS III의 전임상 시험...268
2. BAS IV의 전임상 시험...271
제14절 피부세포의 교차분화 활용 기술 개발...285
1. 각막 표피 줄기세포와 각막 실질세포 동정, 분리 및 피부표피 세포의 각막표피세포로의 교차분화...285
2. 진피잔류 줄기세포 확보, 동정, 신경세포 분화 유도: 진피에서 nestin 발현 SKP 유사 세포군 분리 동정, 특성규명...289
3. SKP 유사 세포군의 4 stage 신경세포 분화 유도 조건 적용...290
제15절 Bioreactor을 이용한 세포 훈련 기술 적용 및 조직 유도 효과 분석...306
1. type II BAS에 cyclic strain 훈련 기술 도입 및 in vitro 조직 형성능 평가...306
2. 세포훈련 기술의 대량화를 위한 생물반응기 제조, 훈련 조건 수립, 안전성 평가: 생물반응기 제조 및 조직화 평가, nude mice이식 후 암화가능성 평가 (안전성)...306
제16절 BAS 임상시도를 위한 BAS 대량 생산의 라인 구축: 지자체 대량 생산, 세포 공정 및 품질표준화 연구...314
1. 지지체 제조공정 완료 및 대량화...314
2. 피부 세포 처리 공정의 효율성, 안전성 및 품질관리 기준 마련...315
3. 생인공 피부 임상시도를 위한 시술방법 및 체계 구축...319
제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도...333
제1절 연구개발목표의 달성도...333
제2절 관련분야의 기술발전에의 기여도...335
제3절 당초 계획한 목표, 내용 및 달성도 자료...337
제5장 연구개발결과의 활용계획...343
제1절 추가 연구의 필요성...343
1. 피부 세포의 교차 분화 연구...343
2. 색소 세포를 이용한 bio-screening system 개발...344
3. 모낭 재생 연구...344
제2절 타 연구에의 응용...346
1. 세포 훈련 기술...346
2. 진피의 신경 전구세포 활용기술 개발...346
3. 상처치유 미세환경 이용기술...347
제3절 기업화 추진 방안...348
제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보...349
제1절 줄기세포 분야의 최근 국내외 과학기술 동향 분석...349
제2절 재생의학의 응용 현황 및 발전 전망...351
1. 서론...351
2. 재생의학의 국내외 연구동향...352
3. 재생의학의 발전 전망...356
4. 국내 연구개발 현황...357
5. 결론...358
제3절 생 인공피부 관련 임상 사례 분석...368
1. 3도 화상 환자의 피부 재생을 위한 autologous keratinocytes sheet를 이용한 시술법과 autologous keratinocytes suspension를 이용한 시술법 비교 분석...368
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