초록 ▼

본 연구과제는 골세포의 활성도를 조절하는 유전자로 알려진 TGF-β계의 유전자 (TGF-β1과 BMP-2)가 삽입된 세포를 만들어 분자생물학 및 생리학적 특성을 조사하고 이 기초의학적 연구를 토대로 임상의학에 응용하여 골절치료, 연골재생, 및 골다공증 치료제 개발로 연결시키고자하는 연구목표를 갖고 있다.

제1세부과제: TGF-β-1의 유전자가 삽입된 안정 세포 군을 만들어 우선 이 세포들이 골아세포의 골형성과정(osteogenesis)에 미치는 영향을 조건배양액을 사용하여 in-vitro에서 관찰하였다. 그리고 이 세포

본 연구과제는 골세포의 활성도를 조절하는 유전자로 알려진 TGF-β계의 유전자 (TGF-β1과 BMP-2)가 삽입된 세포를 만들어 분자생물학 및 생리학적 특성을 조사하고 이 기초의학적 연구를 토대로 임상의학에 응용하여 골절치료, 연골재생, 및 골다공증 치료제 개발로 연결시키고자하는 연구목표를 갖고 있다.

제1세부과제: TGF-β-1의 유전자가 삽입된 안정 세포 군을 만들어 우선 이 세포들이 골아세포의 골형성과정(osteogenesis)에 미치는 영향을 조건배양액을 사용하여 in-vitro에서 관찰하였다. 그리고 이 세포들에서 만들어 내는 TGF-β1 단백질의 양을 정량적으로 측정한 후 인공연골손상이 있는 가토의 무릎에 투과하여 연골재생 능력을 실험하였다. 그 결과 TGF-β1 mRNA와 단백질이 세포 투여후 4주까지 생성되는 것과 6주안에 손상이 연골이 완전히 재생성된결과를 얻게 되었다. 이 연구결과로 TGF-β1 유전자를 이용한 연골 재생성 치료법의 기초를 얻게 되었다.

제2세부과제: 골다공증의 원인인 Ca?대사와 골아 세포 TGF-β 단백질 및 수용체의 관계를 규명하기 위하여 Ca?농도변화가 TGF-β단백질 및 수용체의 전사에 미치는 영향을 luciferase activity 측정과 Northern blot analysis를 통하여 확인하였고 골 육종 세포에 유전자 삽입후의 전사의 정도가 Ca? 농도에 따라 변화하는지 여부를 관찰하였다. 그 결과 Ca? 농도의 변화에도 불구하고 luciferase activity의 변화는 없는 것으로 관찰되었다. 이는 Ca? 농도의 변화에 따른 유전자 삽입의 효율성의 차이가 없다는 결과로 해석된다. 이 후로는 Baculovirus 유전자 운반벡터를 사용한 유전자 운반이 osteogenic 세포들에 가능한 지를 lacZ 표적유전자를 사용하여 검사하고 골 형성에 관여하는 또 다른 TGF-β계유전자 중 하나인 BMP-2 유전자가 삽입된 안정 세포 군을 만들어 골 손상이 있는 가토의 다리에 이세포들을 투여하여 골재생성 능력을 실험하였다. 그 결과 Baculovirus 벡터가 Saos, U2OS 세포들에서 유전자를 효율적으로 운반한다는 사실과 BMP-2 유전자가 삽입된 세포를 투여한 다리에 있었던 골 손상 부위에 새로운 골이 재생됨을 관찰하였다. 이 연구결과는 BMP-2 유전자를 이용한 골재생성 치료법의 가능성을 제시해 주었다고 할 수 있다.

제3세부과제: 골아세포의 세포내 Ca? 활성도의 생리적 조절기전 및 TGF-β1 이 Ca? 조절기전에 미치는 영향을 밝히고자 1차년도에는 골아 세포의 Ca? 활성도의 변화를 측정하기 위한 Calcium Imagetlfgja 방법을 정립하였다. 이러한 실험방법으로 골아 세포의 Ca? 활성도를 조절하는 Na?-Ca? 교환이동기전, 세포내 저장소 고갈로 인한 store-operated calcium influx 기전 및 세포내 저장소로부터의 Ca?-induced Ca? release 기전을 확인하였다.
2차년도에는 골아 세포의 Na?-Ca? 교환이동의 생리적 기능을 조사하고자 Na?-Ca? 교환이동체의 antisense-oligo를 제작하여 Na?-Ca? 교환이동이 골아 세포 내 Ca? 활성도를 조절하는데 중요한 인자임을 확인하였다. 3차년도에는 골아 세포내의 Ca?활성도, NO 조절기전 및 TGF-β1의 상관관계를 조사하기 위해 IL-1β로 NO의 발생을 유도한 후 TGF-β1을 처리하여 NO 발생조절 및 세포내 Ca? 활성도에 미치는 영향을 조사하였다. TGF-β1은 iNOS의 발현 및 NO의 양이 저하시켰으며 Ca?의존성인 eNOS의 발현을 알아보기 위해 TGF-β1이 골아세포내 Ca?활성도에 미치는 영향을 측정한 결과 TGF-β1은 골아세포내 [Ca?]을 서서히 증가시켰으나 eNOS의 발현에는 영향을 주지 않았다. 이상의 결과로 골아 세포내에서 발생되는 고농도의 NO는 TGF-1β에 의해 의미 있게 저하됨을 관찰할 수 있었다. 이상의 세부과제별 결과는 골아세포내의 Ca?활성도 조절기전에 미치는 TGF-β1 에 관한 기초의학적 지식을 얻었으며 TGF-β1을 이용한 골 재생성 치료법의 기초를 확립할 수 있었다고 사료된다

Abstract ▼

The main aim of this research project is to study the molecular biological and physiological characteristics of fibroblast cells transfected with TGF-β family genes. (TGF-β1 and BMP-2) and then to explore the feasibility of clinical application of the cells for the purpose of regeneration of bone an

The main aim of this research project is to study the molecular biological and physiological characteristics of fibroblast cells transfected with TGF-β family genes. (TGF-β1 and BMP-2) and then to explore the feasibility of clinical application of the cells for the purpose of regeneration of bone and cartilage tissues.

First sub-project: The effect of conditioned medium of TGF-β1 stable fibroblasts on the osteogenesis of osteoblast-like cells was studied. After measuring the amount of TGF-β1 protein expression by Quantikine ELISA assay TGF-β1 stable fibroblasts were injected into the knee joints of rabbits with artificially-made cartilage defects. The synthesis of TGF-β1 mRNA and protein was observed by RT-PCR and immunohistochemical staining up to four weeks after injection. These results established a solid basis of cell-mediated gene therapy for the regeneration of hyaline cartilage.

Second sub-project: In order to study the relation between metabolism of Ca? and TGF-β1 protein and its receptor the effect of different concentrations of Ca? on the transcription of TGF-β1 and its receptor of osteoblast-like cells was measured by luciferase activity and Northern blot analysis. The results suggested that the different concentrations of Ca? didn’t affect the transduction efficiency of Baculoviral vector to osteogenic cells was measured and the therapeutic effect of BMP-2 stable fibroblsts was studied with artificially-made bone fracture in rabbits. The results showed that the transduction efficiency of Baculoviral vector containing a marker gene lacZ was very high in Saos and U2OS cells and the bone fracture was healed after eight weeks of injection of BMP-2 stable cells.

Third sub-project: To establish the elementary evidence on the physiological features of osteoblasts the effects of TGF-β1 on intracellular Ca? were studied. Cellular calcium image was established to research the Ca? activity in osteblasts. The results from cellular calcium image suggest that [Ca?] is modulated by Na?-Ca? exchange store-operated Ca? influx and Ca? induced Ca? release.
To study the physiological properties of Na?-Ca? exchange antisense-oligo of Na?-Ca? exchange was manufactured. The results show that Na?-Ca? exchange plays a key role in Ca? signalling in osteoblasts. we exam the effects of TGF-β1 on the synthesis of NO and [Ca?] in osteoblasts. The expression of iNOS is significantly reduced in cells treated with IL-1βand TGF-β1, compared with cells treated with IL-1β alone. This result indicates the TGF-β1 reduced the generation of NO. To exmain Ca? dependant eNOS activities we studied the effects of TGF-β1 on [Ca?] in osteoblasts [Ca?] is slowly increased in osteoblasts treated with TGF-β1. However [Ca?] didn’t affected on the expression of eNOS in osteoblasts. Taken together these results indicate that high concentration of NO generated by tissue damage is reduced partly by TGF-β1. On the base of these evidences the effects of TGF-β1 on [Ca?]i activity was identified and then the elementary source for clinical application of the cells for the regeneration of bone and cartilage tissues was acquired.

목차 Contents

• 총괄연구개발과제 연구결과 ... 9
• 1.총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 9
• 2.총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 11
• 3.총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 12
• 4.총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 15
• 5.총괄연구개발과제의 활용계획 ... 41
• 6.첨부서류 ... 42
• 제1세부연구개발과제 연구결과 ... 43
• 1.제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 44
• 2.제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 45
• 3.제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 46
• 4.제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 47
• 5.제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 48
• 6.제1세부연구개발과제의 활용계획 ... 49
• 7. 참고문헌 ... 49
• 제2세부연구개발과제 연구결과 ... 54
• 1.제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 55
• 2.제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 56
• 3.제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 57
• 4.제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 58
• 5.제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 59
• 6. 제2세부연구개발과제의 활용계획 ... 60
• 7.참고문헌 ... 60
• 제3세부연구개발과제 연구결과 ... 65
• 1.제3세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 66
• 2.제3세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 67
• 3.제3세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 68
• 4.제3세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 69
• 5.제3세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 70
• 6.제3세부연구개발과제의 활용계획 ... 71
• 7.참고문헌 ... 71