초록 ▼

이 연구과제에서는 다음의 세부과제들을 정하여 노화에 관핸 상호 보완적인 공동연구를 수행하고자 하였다.
1)세포노화관련 유전자 탐색 및 기능 연구-Telomerase의 발현과 노화조절
2)세포주기조절인자의 노화조절기전 연구
3)노화와 암화의 제어기전으로서 염색체의 구조적 변화
4)환경요인에 대한 노화세포의 대응-노화과정에 따른 세포막 수용체성 엔도사이토시스 기능변화
5)노화제어 식품 및 의약품 원료 개발-솔잎추출물로부터 항노화물질의 개발
6)노화관련 유해물질 제거 방안 연구

이 연구과제에서는 다음의 세부과제들을 정하여 노화에 관핸 상호 보완적인 공동연구를 수행하고자 하였다.
1)세포노화관련 유전자 탐색 및 기능 연구-Telomerase의 발현과 노화조절
2)세포주기조절인자의 노화조절기전 연구
3)노화와 암화의 제어기전으로서 염색체의 구조적 변화
4)환경요인에 대한 노화세포의 대응-노화과정에 따른 세포막 수용체성 엔도사이토시스 기능변화
5)노화제어 식품 및 의약품 원료 개발-솔잎추출물로부터 항노화물질의 개발
6)노화관련 유해물질 제거 방안 연구

제1, 2, 3 세부과제에서는 각각 telomerase, 세포주기조절인자와 transglutaminase에 관한 연구를 통해 세포의
노화 및 암화기전을 밝히고 그 조절방안을 강구하며 제4세부과제에서는 노화에 따라 일어나는 분비세포와 내피세
포의 기능변화의 기전을 규명하고 그 조절방안을 강구하며 제 5, 6, 세부과제에서는 생체의 면역능을 강화하고 생
체내 산화적 stress를 완하하는 방안과 노화유도물질을 제거하는 방안을 연구하고자 하였다.
약 3년간의 연구를 통하여 다음의 주요 연구결과를 얻었다.

제1세부과제-Telomere는 염색체의 말단에 위치한 특수구조로써 염색체 말단을 보호하고 DNA 복제를 완성하는데 필수
적인 역할을 수행한다. 본 과제에서는 telomere DNA의 길이조절에 관련된 분자생물학적 기작을 총체적으로 이해
하기 위하여 telomerase와 결합하여 상호작용하는 단백질을 규명하고 그 기능을 이해하려는 연구를 수행하였다.

그 결과 DNA 손상신호전달계에 관련된 단백질이 telomerase와 결합한다는 새로운 발견을 하여 telomerase에 의
한 telomere DNA의 합성이 DNA 손상신호와 관련되어있다는 사실을 관찰 하였다. 또한 항암제인 adriamycin에 내
성을 갖는 세포주를 분리하여 telomerase 활성과 telomere 길이조절이 항암제 조절하는 유전자의 변형을 통하여
노화 및 세포 불멸화에 관련된 질병의 치유와 예방을 가능하게 할 분자생물학적 기초지식을 제공하게 될 것이
다.

제2부과제-세포분열주기 억제인자인 p16 게놈유전자 메칠화를 측정하는 방법을 확립하여 HDF 1차 배양세포는 p16 메
칠화 현상이 전혀 없는 세포임을 확인하였다. 세포노화 과정에서 흔히 발견되는 세포골격의 변화는 G-actin 분자
의 핵외부로 배출이 억제되어 있으며 epidermal growth factor 자극에 의한 E가-p의 핵내 이동에 이상이 발생한
사실을 발견하였다. 이때 G-actin이 핵에서 나오지 못하는 것은 탈인산화된 cofilin 발현이 증가하였기 때문이
며 E가-p 단백질의 증가는 MEK의 활성이 증가되었기 때문인 것을 규명하였다.

제3세부과제-본 과제는 염색체의 구조적 변화가 세포의 노화 및 암화에 어떠한 기여를 하는지를 조사하는 것으로 구
체적으로는 세포의 노화에 따라 증가되어 가는 transglutaminaseC (TGc)의 기질이 염색체 구조 형성의 기본단위
의 histone이고 TGc 에 의한 histone의 crosslinking이 세포노화에 따른 DNA 대사변화의 근복적인 요인이라는 가
설을 증명하는 것이었다. 우선 TGc를 human RBC에서 그리고 chromatin/chromatosome/octamer/H3-H4 dimer와 H2A-
H2B dimer들을 chicken RBC에서 각각 성공적 분리하였고 이를 이용하여 in vitro에서 반응시킨 결과 ①chromatin
을 기질로 하였을 때 H2A 와 H2B가 특이적으로 cross-link되는 것을 관찰②DNA가 감겨있는 상태보다는 octamer
의 H2A-H2B crosslinking이 더욱 쉽게 일어남 ③H2A와 H2B의 C terminal 의 unstructured region 사이에 cross-
linking이 일어남④crosslink된 H2A-H2B는 nuclesosme에 assemble 되지못함 ⑤chicken RBC에 이미 crosslink된
H2A-H2B가 존재함을 관찰하였다. 따라서 간접적이지만 TGc가 세포의 노화과정중에 염색체의 구조변화를 야기할
수 있다는 것을 충분히 입증한 결과를 가졌다.

제4세부과제-노화 섬유아세포에서 외부환경에 대한 반응 기작으로 엔도사이토시스 기능의 변화를 관찰하였다. 노화
섬유아세포에서 수용체를 통한 트랜스페린이 이입이 일어나지 않았다. 엔도사이토시스에 관여하는 단백질들을 분
석한 결과 clathrin, α-adaptin β-adaptin dynamin 등의 단백질은 노화에 따라 그 발현이 변하지 않았으나
amphicphysim 1의 양이 노화세포에서 발현이 줄어들었다. 이러한 현상은 젊은 세포에 dominant negative 변이형
amphiphysim 1 단백딜을 과발현 시킬 때도 볼 수 있었다. 이로써 노화세포가 외부에 적절히 대응하지 못하는 이
유는 amphiphysin 1 단백질 양의 감소 때문인 것을 알 수 있었다.

제5세부과제-솔잎이 인체 세포매개성 및 채액성 면역능에 미치는 영향을 알아보기 위해 사람을 대상으로 KTH, T 림
프구 및 T 림프구 아형의 수 측정, 혈중 IL-1β, IL-2, PGE₂, 농도측정, 그리고 혈중 Immunoglobulin G, A, M 농
도를 측정하였다. 그 결과 솔잎환 복용에 의해 혈중 PGE₂농도가 감소하고 DTH 측정에 의한 양성반응갯수가 증가
하는 것으로 나타나 인체의 세포매개성 면역능을 증진시킬 수 있을 것으로 기대되었다.
솔잎으로부터 항산화능이 우수한 Pk-A와 B 분획을 추출하여 이들의 활성산소소거능과 지질과산화 억제능 및 배
양세포에서의 활성산소소거능과 막유동성 손상 억제능을 구명하여 이들이 세포노화 억제능에 기여할 수 있을 것
이라 사료된다. 특히 Pk-A 분획은 분자구조로 확인결과 epicatechin임을 밝혀졌다.
동물실험을 통한 솔잎 유효성분의 항노화효과 및 구조 해명연구의 일환으로서 SD계랫트의 혈청 및 뇌의 여러가
지 생리활성에 미치는 솔잎 추출물, ethyl acetracte(EtOAc) 및 butanol(BuOH)분획의 투여효과를 구명하였다.
그 결과 성인병, 노화, 스트레스, 기억·학습 및 치매는 이들 솔잎 추출물, EtOAc 및 BuOH 획분의 투여에 의하
여 매우 효과적으로 조절될 것이라는 사실이 입증되었다. 또한 dihydrokaempferol (+)-catechin 같은 폴리페놀화
합물이 여러 가지 바람직한 생리작용에 관계할 것이라 사실이 입증되었다.

제6세부과제 -여러 flavonoid 화합물 중 catechin 화합물이 포도당과 단백질의 산화를 효과적으로 억제하였으며 이
를 바탕으로 catechin을 다량 함유하는 녹차를 사용하여 동물실험을 시행하였다. 그결과 streptozotocin으로 고
혈당을 유발한 흰쥐에서 녹차섭취에 따라 대동맥 collagen의 당화가 감소하였으며 흰쥐의 노화과정에서 녹차를
섭취시킨 군에서는 대동맥과 피부 collagen의 산화가 감소되었고 대동맥 collagen의 당화가 감소되었음이 관찰되
었다.
DNA 산화적 손상의 하나인 8-hydroxyguanine(oh?Gua)의 노화와의 관련성을 규명하기 위해 노화촉진생쥐(SAM)에
서 행한 예비실험에서 oh?Gua의 함량 증가와 그 수복효소(oh?Gua DNA glycosylase OGG)의 활성 저하를 발견하였
다. 본 연구는 노화촉진생쥐에서 OGG 효소활성 저하의 분자적 기전을 그 유전자 수준에서 밝히고자 하였으며 연
구결과 ogg1 유전자의 304번 codon에서 점 돌연변이가 발견되었다. 이 돌연변이는 효소의 활성과 안정성을 감소
시키는 것도 확인되었다.

Abstract ▼

This was designed as a multidisciplinary project to study on unknown pathophysiology and underlying mechanisms of senescence and related diseases and to develop new agents and measures modulating the senescence-associated processes. This study consists of six parts : 1. Regulation of telomerase and

This was designed as a multidisciplinary project to study on unknown pathophysiology and underlying mechanisms of senescence and related diseases and to develop new agents and measures modulating the senescence-associated processes. This study consists of six parts : 1. Regulation of telomerase and senescence. 2. Mechanisms of increased cell proliferation and alteration of cell division during cellular senescence. 3. Implication of transglutaminase C in cellular aging. 4. Changes in receptor-mediated endocytosis in the senescent cells. 5. Isolation of substances with anti-senescence effects from pine needles. 6. Prevention of age-associated changes in proteins and DNA,
The following results have been obtained for 3 years.

Telomeres are the essential and functional components of eukaryotic chromosome ends that protect chromosomes from exonucleolytic degradation or end-to-end fusion and allow complete replication of the ends. In this proposal we performed the yeast two-hybrid screening to identify a novel protein which interacts with telomerase complex. This study is essential to understand the regulatory mechanism in maintaining the length of telomere DNA. The results indicate that telomerase is associated with the signaling protein which is involved in DNA damaging pathway. We also present a novel example of telomere elongation mechanism in a human stomach adenocarcinome cell line which was selected for resistance to adriamycin. The results will provide a fundamental information at the molecular level which enable to aid in the treatment and cure of cancer and other aging-related diseases.

Cytoplasmic retention of p-Erk1/2 and nuclear accumulation of G-actin molecules were observed during cellular senescence in humal diploid fibroblast as well as the H-ras double mutants V12S35-, V12G37, and V12C40-, overexpressing cells. These changes were accompained with the induction of dephosphorylated cofilin expression in the nucleus and the increase of MEK expression in the senescent cells.

TGc has been shown to increase its activity and amount during cellular ageing and to translocate into nucles under a certain condition. It therefore was possible that it crosslinks histones in nucleus thereby it plays a role in the changes of DNA metabolism during cellular aging. To examine this possibility we purified TGc from human RBC and chromatin/chromatosome/octamer/H3-H4 dimer and H2A-H2B dimer from chicken RBC. Based on in vitro experiments with these proteins we found ①using chromatin as a substrate that H2A and H2B are specifically cross-linked, ②those histones present in DNA-free octamer are crosslinked more readily than those in chromatin or chromatosome ③the crosslinking is between those residues present at the C-terminal flexible arms of H2A and H2B ④the crosslinked H2A and H2B are not assembled into nucleosome ⑤ the crosslinked H2A and H2B are already present in the chromatin from chicken nucleus. Although indirect these results supports notion that H2A-H2B crosslinking by tTGase may influence the chromatin structure resulting in the changes in various DNA metablism observed during cellular aging.
Senescent cells have a characteristic feature like improper responsiveness to external stimuli and inefficient uptake of materials. Using transferrin-uptake assay and western blot analysis on endocytosis-related proteins we found that a significant decrease of amphiphysin-1 is related to the reduction of receptor-mediated endoyctosis in human diploid fibroblasts of multipassages. We could demonstrate that dominant negative mutant amphiphysin-1 in presenescent cells reduced the uptake of transferrin. We suggest than the loss of endocytotic activity of senescent cells is due to the down-regulation of amphiphysin-1which might be a good target for functional analysis on age-related diseases.

When volunteers were ingested with pine needle pellets(5g per day) for four weeks the blood PGE₂level and the number of positive responses in DTH(dealyed type hypersensitivity) were significantly increased suggesting the cell-mediated immunity could be enhanced by pine needle supplementation in human. And the feeding effects of pine needle extract(PNE) and ethyl acetate(EtOAc and butanol(BuOH) fractions on various physiological activities in serum and brain of SD rat were investigated. The results suggest that chronic degenerative disease aging stress laerning and dementia may be effectively modulated by adminsitrations of pine needle extract EtOAc and BuOH fractions and that polyphenol compounds such as dihydrokaempferol and (+)- catechin are related with the various desirable physiological actions. inhibited free radical generation and free radical-induced demages in cultured cells as well as biochemical examinations. These results suggest that these fractions could protect cells from age-associated changes. The Pk-A fraction was identified as an epicatechin by NMR and LC/MS.

Catechins were found to inhibit effectively the oxidative modification of glucose and proteins in vitro. In streptozotocin-induced diabetic rats green tea inhibited the glycation of aortic collagen. Also green tea inhibited the age-associated accumulation of carbonyl groups and advanced glycation end products in tissue collate. In our previous study to explore the role of 8-hydroxyguanine (oh?Gua) in senescence-accelerated mouse (SAM) we found elevation of oh?Gua content in DNA and decrease of its repair enzyme 8-oxoguanine glycosylase (OGG). In this study we attempted to reveal the molecular basis of these changes by analyzing the gene for this enzyme ogg1. Finally we found a point mutation of oggI from SAM at codon 304 which was subsequently confirmed to be responsible for the decrease and instability of its enzyme activity.

목차 Contents

• 총괄연구개발과제 연구결과...9
• 1.총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...9
• 2.총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...22
• 3.총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...31
• 4.총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...36
• 5.총괄연구개발과제의 활용계획...41
• 6.첨부서류...44
• 1.제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...113
• 2.제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...113
• 3.제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...115
• 4.제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...119
• 5.제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...121
• 6.제1세부연구개발과제의 활용계획...122
• 7.참고문헌...122
• 제2세부연구개발과제 연구결과...125
• 1.제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...127
• 2.제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...127
• 3.제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...128
• 4.제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...133
• 5.제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...134
• 6.제2세부연구개발과제의 활용계획...135
• 7.참고문헌...135
• 제3세부연구개발과제 연구결과...137
• 1.제3세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...139
• 2.제3세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...142
• 3.제3세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...146
• 4.제3세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...154
• 5.제3세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...155
• 6.제3세부연구개발과제의 활용계획...156
• 7.참고문헌...157
• 제4세부연구개발과제 연구결과...159
• 1.제4세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...161
• 2.제4세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...162
• 3.제4세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...168
• 4.제4세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...183
• 5.제4세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...187
• 6.제4세부연구개발과제의 활용계획...188
• 7.참고문헌...188
• 제5세부연구개발과제 연구결과...193
• 1.제5세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...195
• 2.제5세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...197
• 3.제5세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...218
• 4.제5세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...240
• 5.제5세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...244
• 6.제5세부연구개발과제의 활용계획...248
• 7.참고문헌...249
• 제6세부연구개발과제 연구결과...255
• 1.제6세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...257
• 2.제6세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...260
• 3.제6세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...266
• 4.제6세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...277
• 5.제6세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...279
• 6.제6세부연구개발과제의 활용계획...280
• 7.참고문헌...281