초록 ▼

1. 연구개발사업의 목표
Adipocyte에서 다량 발현되고 있는 PPAR-γ는 preadipocyte의 분화에 관여하며 생체내의 지방대사에 관여하는 유전자는 발현을 조절하는 등 지질과 글루코스의 homeostasis에 중요한 기능을 나타내고 있다. 최근 PPAR-γ의 antagonist에 의해 활성이 저해되면 adipocyte 내로의 지방 축적이 감소된다는 보고가 있었다. 우리는 이러한 결과를 응용하여 PPAR-γ의 활성을 저해시키는 물질을 screening 하여 비만치료제로서의 가능성이 있는 물질을 선별하고 이물질을

1. 연구개발사업의 목표
Adipocyte에서 다량 발현되고 있는 PPAR-γ는 preadipocyte의 분화에 관여하며 생체내의 지방대사에 관여하는 유전자는 발현을 조절하는 등 지질과 글루코스의 homeostasis에 중요한 기능을 나타내고 있다. 최근 PPAR-γ의 antagonist에 의해 활성이 저해되면 adipocyte 내로의 지방 축적이 감소된다는 보고가 있었다. 우리는 이러한 결과를 응용하여 PPAR-γ의 활성을 저해시키는 물질을 screening 하여 비만치료제로서의 가능성이 있는 물질을 선별하고 이물질을 순수 분리하여 신약 후보물질로 개발하는 것을 목표로 하였다.

목표 1. 비만치료를 위한 PPAR-γ억제제의 개발을 위해 yeast two-hybrid system을 이용한 탐색법을 개발하고 이를
이용하여 생약 추출물 및 균액 추출물에서의 억제 물질을 탐색함.
목표 2. 탐색된 물질의 순수분리 및 구조 결정을 하여 후보 물질을 개발함.
목표 3. 개발된 물질의 지방세포분화 억제능력을 조사하여 활성을 확인함.

2. 연구개발사업의 연구방법
본 실험에서는 신약 스크리닝을 위한 방법으로써 yeast two hybrid system을 사용하였다. PPAR-γ가 세포내에서 활성화되기 위해서는 RXR과의 상호결합이 필수적이므로 bait 백터인 pEG202에는 RXR을 prey 백터인 pYESTrp에는 PPAR-γ를 construction하여 효모 EGY48에 cotransformation 한후 우라실. 히스티딘, 트리토판이 결핍된 갈락토스 배지에서 성장할 수있으나 억제제에 의해 PPAR-γ와 RXR과의 상호작용이 방해를 받게되면 류시이 없는 배지에서는 성장을 할 수 없게 된다. 본 실험자는 이처럼 성장을 저해시키는 시료에 대해서 1차적으로 후보물질로 선별한후 백터만 함유된 대조군과 비교하여 대조군에는 영향을 주지 않으면서 PPAR-γ에 대해 억제활성을 특이적으로 나타내는 후보물질만을 다시 선별하였다. Screening은 우선 방선균 배양액 생약 추출물과 곰팡이 배양액에서부터 시작하였다.
방선균과 곰팡이 배양액의 경우는 디스크법을 이용하여 시료를 적신 디스크를 형질전환된 효모를 깔아놓은 플레이트에 올려놓고 배양시켰을 때 성장 저지원을 형성시키는 시료를 선별하는 방식을 이용하였고 생약시료의 경우는 96well plate에서 우라실, 히스티딘, 트립토판과 류신이 없는 액체배지에 효모를 접종후 각 시료를 떨어뜨려 시료를 처리하지 않은 대조군과 660nm에서 흡광도를 측정하고 그 수치를 비교함으로써 효모 성장 저해 물질을 선별하는 방법을 택하였다. 한편 효모에서 활성을 나타내던 위의 후보물질을 이용하여 동물세포에서도 다른 활성에는 영향을 주지 않으면서 PPAR-γ의 활성에만 영향을 보이는지 확인해 보고자 하였다. 동물세포에서 시료의 활성을 쉽게 검색할 수 있게 하기 위해 PPAR-r의 발현백터와 리포터 벡터를 293 cell, COS cell에 cotransfection 하여 G418로 선별한 stable cell line을 제조하였다
리포터 벡터는 PPAR-γ가 결합하는 element인 PPPRE가 4회 반복되도록 연결하여 SEAP리포터 벡터의 promoter site 앞에 삽입 되도록 제조한 것으로 동물세포 내에서 과다발현된 PPAR-γ가 리포터 벡터의 PPRE에 결합하게 되면 SEAP 유전자가 발현되어 간접적으로 PPAR-γ의 활성을 확인할 수 있게 하였다.
또한 선별된 물질이 세포의 분화에 영향을 주는 지 직접 확인 해보고자 preadipocyte로 알려진 3T3-L1 cell을 이용하여 기존에 보고되어진 PPAR-γ의 antagonist인 BADGE를 대조구로 사용하여 효모에서 활성을 나타낸 시료를 처리후에 세포분화가 억제되는지 확인하기 위한 실험을 진행하였다.

Abstract ▼

1. Purposes

The peroxisome proliferator-activated receptor-gamma (PPAR-v) is a ligand dependent transcription factor that is important in adipocyte differentiation and glucose homeostasis and which depends on interactions with co-activators including retinoid X receptor(RXR). As no complete P

1. Purposes

The peroxisome proliferator-activated receptor-gamma (PPAR-v) is a ligand dependent transcription factor that is important in adipocyte differentiation and glucose homeostasis and which depends on interactions with co-activators including retinoid X receptor(RXR). As no complete PPAR-v antagonists which may be a cadidates for the anti-obesity drug have been described hitherto we have tried to develop the screening method to find the inhibitory compounds against the PPAR-v activity. Using this method we have tried to find the candidates for the PPAR-v antagonist from various sources such as culture broth of the Streptomyces species fungal culture extracts and plant extracts. The isolation and purification of the active compounds would be proceeded and determined the structure of the compounds.

2. Methods

The screening method was designed by modifying the yeast two-hybrid system which is based on the interaction between PPAR-gamma and RXR. The procedure of this experiment was as followed.
(1) Development of screening method to find the PPAR-γinhibitor using yeast two-hybrid (Y2H) system
①Construction of pLexA/PPAR-γ, pLexA/RXr, pLexA/ARA70 and pB42/PPAR-γ
②Establishment of yeast strain containing pLexA/PPAR-γ
③Establishment of yeast strain containing pLexA/RXR and pB42/PPAR-γ
④Establishment of yeast strain containing pLexA/ARA70 and pB42/PPAR-γ
⑤Development of the three Y2H methods for screening PPAR-γ inhibitor using established yeast strains
both on agar plate and 96 well plate
⑥Determination of the screening conditions for Y2H method
(2) Development of screening method to find the PPAR-γinhibitor using mammalian cell system
①Establishment of the PPRE-dependent reporter system in mammalian cell
②Construction of PPRE-dependent reporter vector
③Establisment of the PPRE-dependent reporter cell line
(3) Screening purification and structure determination of the active compounds
①Screening of the culture broth of the Streptomyces species fungal culture extracts and plant extracts
to find the PPAR-γ inhibitor using the developed methods.

②Purification and structure determination of the acitve compounds.
(4) Establishment of the adipocyte differentiation method and its application
①Determination of the induction condition for differentiation preadipocyte to adipocyte
②Determination of the staining condition for the differentiated adipocyte
③Test for the inhibitory effects on this stystem using the candidate compounds

목차 Contents

• 총괄연구개발과제 연구결과...8
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...8
• 2. 연구개발내용의 우수성 및 창의성...9
• 3. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...11
• 3-1. 연구내용...11
• 3-2. 연구 결과...17
• 4. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...52
• 5. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...53
• 6. 총괄연구개발과제의 활용계획...55
• 7. 참고문헌...56