초록 ▼

케라틴은 표피에 가장 풍부하게 존재하는 세포간 섬유상 연결 단백질로서 케라틴은 분자량이 크며 시스틴 이중황화결합(cystine disulfide bonds)에 의해서 연결되어 있기에 불용성이며 잘 분해되지 않고 분자량이 큰 이유로 세정제 단독으로는 쉽게 제거하지 못한다. 최근, 이러한 단백질 불순물을 제거하는 효과적인 방법으로 단백질 분해 효소를 이용하여 직접적으로 피부 표면에 부착된 케라틴 층을 분해제거 가능하다고 보고되어 있다.
본 연구에서 케라틴 분해활성이 있는 단백질 분해효소를 생산하는 미생물을 탐색하여 분리하고 이

케라틴은 표피에 가장 풍부하게 존재하는 세포간 섬유상 연결 단백질로서 케라틴은 분자량이 크며 시스틴 이중황화결합(cystine disulfide bonds)에 의해서 연결되어 있기에 불용성이며 잘 분해되지 않고 분자량이 큰 이유로 세정제 단독으로는 쉽게 제거하지 못한다. 최근, 이러한 단백질 불순물을 제거하는 효과적인 방법으로 단백질 분해 효소를 이용하여 직접적으로 피부 표면에 부착된 케라틴 층을 분해제거 가능하다고 보고되어 있다.
본 연구에서 케라틴 분해활성이 있는 단백질 분해효소를 생산하는 미생물을 탐색하여 분리하고 이를 Bacillus. sp. HB-5 라 명명하였으며, 그 생산 단백질 분해효소를 DEAE-cellulose 이온교환 컬럼과 Sephadex G-100 겔 컬럼을 이용하여 분리, 정제하였다. 정제된 효소는 SDS-PAGE에 의해 75 KDa 정도의 분자량을 지닌 것으로 나타났으며, pH 8에서 가장 안정하고, 60℃에서 30분 이상 안정하였다. 2가의 Ba, Mn 등과 저농도의 Fe에 의해 활성화되며 2가의 Hg, Cu, Zn에 의해 저해되는 것으로 나타났다.
Bacillus sp. HB-5가 생산하는 단백질 분해효소의 생산량을 증대시키기 위하여 여러 가지 종류의 탄소원 및 질소원을 검토하였으나 탄소원으로서는 glucose를, 질소원으로서는 ammonium sulfate를 이용하는 경우 단백질 분해효소의 활성이 높은 것으로 조사되었다. Pilot plant를 대량배양 후 전체 정제공정에서 약 12.9% 정도의 단백질 분해효소가 손실되었으나, 원심분리, microfiltration, ultrafiltration, 동결건조를 거쳐 단백질 분해효소의 대량생산을 위한 공정시스템을 확립하였다.
본 연구에서는 당사에서 기 분리한 300 여종의 미생물이 생산하는 다당류를 대상으로 단백질 분해효소의 안정성을 증대시키고, 동시에 화장품에 첨가하였을 경우 다당류가 가지는 보습능, 피부재생능력, 면역활성 증대 등의 효과를 동시에 얻고자 다양한 종류의 미생물유래 다당류를 검토한 결과, Aureobassidium sp. A-78이 생산하는 다당류를 1% 수준으로 첨가하는 경우 보존 중 가장 높은 단백질 분해효소의 활성을 나타내었다. 또한, Aureobassidium sp. A-78이 생산하는 다당류는 보습능, 피부자극 경감 효과, 피부재생 효과도 가지는 것으로 나타나 화장품 첨가제로 개발시 여러 가지 다양한 장점을 발휘할 수 있을 것으로 기대된다.

Abstract ▼

Keratin is a fibrous protein that constitutes a functional barrier in cornified cells between living thing and their environment. Keratinous proteins are insoluble and resistant to degradation by common proteolytic enzymes because of its extensive cross-liking by disulfide bonds, hydrogen bonding, a

Keratin is a fibrous protein that constitutes a functional barrier in cornified cells between living thing and their environment. Keratinous proteins are insoluble and resistant to degradation by common proteolytic enzymes because of its extensive cross-liking by disulfide bonds, hydrogen bonding, and hydrophobic interaction. Despite the unusual stability of keratinous protein, several microbial keratinolytic protease have been reported. Recently, loss of high molecular weight of polypeptides of keratin and fragmentation of keratin polypeptides have been found in some diseased skin such as in psoriatic and cancerous conditions. In psoriatic epidermis, inin which accelerated proliferation of keatinized cells involved, elevated levels of enzymatic activities have been found.
Bacillus sp. HB-5 was isolated from soil of a henhouse. Identification of the isolate was based on a detailed study of its physico-chemical gross characterization and microscopic morphology and comparison with standard reference. The keratinolytic protease was purified to homogeneity using hydrophobic interaction chromatography and gel chromatography. The molecular weight was estimated to be 75 KDa from SDS-PAGE analysis. The optimal pH and temperature for keratinolytic activity were pH 8 and 60℃. The serine protease inhibitor PMSF totally inhibited the keratinolytic activity. The keratinolytic activity was inhibited by Hg, Cu, Zn and activated by Ba, Mn, and low concentrations of Fe.In the flask test of Bacillus sp. HB-5, the optimal carbon or nitrogen source were glucose and ammonium sulfate. For the mass production of keratinolytic protease using pilot scale fermantation, the medium contained the following (g/L): glucose 30.0, K₂HPO₄ 2.2, KH₂PO₄ 0.3, MgSO₄·7H₂O 0.3, NaCl 0.5, yeast extract 5.0, hair hydrosate 15 ml, pH 7.5. Under the above conditions, the maximum production of keratinolytic protease activity was about 280 unit/ml after 24 hours. After fermentation, keratinolytic protease was purified by centrifugation, microfiltration, ultrafiltration, and freeze dry.In order to enhancement the preservation periods of keratinolytic protease, several microbial polysaccharide was tested. Among these microbial polysaccharide tested, the polysaccharide produced by Aureobassidium sp. A-78 was most effective additive for the preservation of keratinolytic protease activity. Additionally, micriobial polysaccharide produced by Aureobassidium sp. A-78 was effective for skin moisturizing, anti-irritancy, cell proliferation.

목차 Contents

• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...7
• 1) 연구배경...7
• (1) 기술적 배경...7
• (2) 경제적 배경...8
• (3) 국내 및 세계시장의 제품개발 동향...8
• 2) 연구목적...9
• 3) 연구범위...10
• 4) 연구개발 추진체계...11
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...12
• 1) 단백질 분해효소의 분리 및 정제공정확립...12
• (1) 단백질 분해효소 생성균주의 분리...12
• ① 단백질 분해효소 생성균주의 분리...12
• ② Skim milk agar plate assay에 의한 확인...13
• ③ 단백질 분해효소의 활성측정 방법...13
• (2) 단백질 분해효소의 정제...14
• ① 배양액의 농축...14
• ② DEAE-cellulose chromatography...15
• ③ Sephadex G-100 chromatography...15
• ④ SDS-polyacrylamide gel electrophoresis...16
• (3) 단백질 분해효소의 특성 및 각질제거 효과...17
• ① 분자량의 결정...17
• ② 단백질 분해효소의 저해제에 대한 효소활성의 영향...18
• ③ 단백질 분해효소의 pH 안정성...19
• ④ 단백질 분해효소의 열안정성...20
• ⑤ 단백질 분해효소의 활성에 미치는 금속이온의 영향...21
• ⑥ 단백질 분해효소의 케라틴 분해능...22
• ⑦ Image analyzer를 이용한 각질제거 확인 시험...24
• 2) 단백질 분해효소 생산미생물의 대량배양 및 최적 배양 조건 확립...24
• (1) 최적 배양 조건 확립...24
• ① 탄소원의 검토...25
• ② 질소원의 검토...27
• (2) Pilot plant를 이용한 단백질 분해효소의 대량생산...29
• (3) 대량배양시 정제 공정의 확립...31
• 3) 단백질 분해효소의 안정화를 위한 최적의 첨가제 개발...33
• (1) 미생물유래 다당류를 이용한 화장품 첨가제 개발...33
• (2) Aureobassidium sp. A-78의 화장품 첨가제로의 개발...35
• ① Aureobassidium sp. A-78이 생산하는 다당류의 분리·정제...35
• ② Aureobassidium sp. A-78이 생산하는 다당류의 단백질 분해효소 보존성...35
• ③ Aureobassidium sp. A-78이 생산하는 다당류의 보습능...36
• ④ Aureobassidium sp. A-78이 생산하는 다당류의 피부자극성 저감 효과...37
• ⑤ Aureobassidium sp. A-78이 생산하는 다당류의 피부재생 효과...38
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...40
• 1) 단백질 분해효소의 분리 및 정제공정 확립...40
• 2) 단백질 분해효소 생산미생물의 대량배양 및 최적 배양 조건 확립...40
• 3) 단백질 분해효소의 안정화를 위한 최적의 첨가제 개발...41
• 4) 결론...42
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...43
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획...45
• 6. 첨부서류...45
• 7. 참고문헌...46