2001년 유전자재조합품 안전관리사업 연구보고서;유전자재조합식품 내 재조합 단백질의 앨러지원성 조사방법의 개발원문보기
보고서 정보
주관연구기관
영남대학교 YeungNam University
연구책임자
남두현
발행국가
대한민국
언어
한국어
발행년월
2001-12
주관부처
식품의약품안전청
사업 관리 기관
영남대학교 YeungNam University
등록번호
TRKO200300001370
DB 구축일자
2013-04-18
키워드
유전자 재조합 콩.앨러지원성.수동피부아나필락스.비만세포.5-Enolpyruvylshikimate Synthase.Genetically Modified Soybean.Allergenicity.Passive CutaneousAnaphylaxis.Mast Cell.5-Enolpyruvylshikimate Synthase.
초록▼
1) 유전자 재조합 콩 내 재조합된 유전자의 확보유전자 재조합 콩의 chromosomal DNA를 template로 하여 유전자 증폭법으로 재조합된 유전자를 증폭하고, 이의 염기서열을 결정하여 재조합된 유전자가 제초제 내성을 나타내는 EPSPS 유전자인지 여부를 확인하였다 2) 유전자 재조합 콩 내 재조합된 유전자의 대장균 내 발현 및 생산유전자 재조합 콩으로부터 증폭시킨 EPSPS 유전자를 대장균의 발현 운반체인 pET28(a) plasmid에 도입하고, 유전자 발현 유도물질인isopropyl-β-D-thiogalactopy
1) 유전자 재조합 콩 내 재조합된 유전자의 확보유전자 재조합 콩의 chromosomal DNA를 template로 하여 유전자 증폭법으로 재조합된 유전자를 증폭하고, 이의 염기서열을 결정하여 재조합된 유전자가 제초제 내성을 나타내는 EPSPS 유전자인지 여부를 확인하였다 2) 유전자 재조합 콩 내 재조합된 유전자의 대장균 내 발현 및 생산유전자 재조합 콩으로부터 증폭시킨 EPSPS 유전자를 대장균의 발현 운반체인 pET28(a) plasmid에 도입하고, 유전자 발현 유도물질인isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)로 도입된 유전자의 발현을 유도하여 EPSPS의 생산 정도를 관찰하였다 3) 유전자 재조합 콩 내 재조합된 단백질의 분리 정제대장균 내에서 발현된 유전자 재조합 콩의 재조합 단백질인 EPSPS를 6M urea로 용출한 다음, immobilized nickel-affinity columnchromatography 방법으로 순수 분리 정제하고, 이를 투석 후 동결 건조시켜 항원성 연구에 필요한 량의 EPSPS 단백질을 확보하였다 4) 유전자 재조합 콩 내 재조합된 단백질의 인공위액에서의 안정성 조사순수 분리 정제한 EPSPS 단백질의 소화 유무를 판단하기 위해, pepsin을 함유한 인공위액 (pH 1.2)으로 처리하여 재조합 단백질의 분해 정도를 관찰하였다 5) 수동 피부 아나필락시스에 의한 유전자 재조합 콩 내 재조합 단백질의 앨러지원성 조사순수 분리 정제한 EPSPS 단백질을 대상으로 식품의약품안전청 고시에 수재된 항원성 시험 기준의 감작 일정에 따라 rat를 감작시키고, 최종감작 1주일 후 분리한 감작 혈청을 비감작 rat의 배부에 피내투여를 실시하여 감작 혈청 중 존재하는 immunoglobulin E (IgE)에 특이적인 Evansblue의 유출정도를 관찰하는 수동 피부 아나필락시스 반응을 실시함으로써 EPSPS 단백질 항원에 특이적인 항체의 존재 여부를 확인하였다 6) Ex vivo 실험을 통해 비만세포에서의 유전자 재조합 콩 내 재조합 단백질의 앨러지원성 조사Sprague Dauley계 랫드 수컷에 순수 분리 정제한 재조합 EPSPS 단백질을 0, 5 및 20mg/kg의 용량으로 총 9회 경구로 투여한 6일 후, 재조합EPSPS 단백질을 경구 투여한 rat의 복강액으로 부터 비만세포를 분리하고, 분리한 비만세포 배양액에 항원으로 사용한 재조합 EPSPS 단백질을10μg/ml을 처리하여 배양액으로 유리되는 histamine 및 cytokine (tumor necrosis factor-α (TNF-α) 및 interleukin-4(IL-4))의 량을 측정하여 비만세포에서의 앨러지 유발능을 조사하였다 7) In vitro 실험을 통한 비만세포에서의 유전자 재조합 콩 내 재조합 단백질의 앨러지원성 조사In vivo 재조합 EPSPS 단백질을 0, 0.5 및 2mg/kg의 용량으로 경구 감작시켜 얻은 항혈청을 얻고, 이를 무감작 Sprague Dawley계 rat에서 분리한 비만세포의 배양액에 이 항혈청 5%를 16시간 처리할 때, k IgE 특이적인 histamine 유출 및 cytokine (TNF-α 및 IL-4) 유리 정도를 관찰하여, in vitro에서 유전자 재조합 콩 내 재조합 단백질이 비만세포에서의 앨러지 유발능을 조사하였다
Abstract▼
The recombinant gene in genetically modified (GM) soybean was amplified from the chromosomal DNA by employing primersin the range of 35S promoter at 5′-end and in the range of NOS terminator at 3′-end, to yield 2.1 kb of DNA fragment. The amplifed DNA was inserted into pGEM-T vector to construct pGM
The recombinant gene in genetically modified (GM) soybean was amplified from the chromosomal DNA by employing primersin the range of 35S promoter at 5′-end and in the range of NOS terminator at 3′-end, to yield 2.1 kb of DNA fragment. The amplifed DNA was inserted into pGEM-T vector to construct pGMO-T plasmid, and its nucleotide sequence was determined by dideoxy method The determined nucleotide sequence revealed that the amplified DNA contains the epsps gene encoding5-enolpyruvylshikimate synthase (EPSPS) which showed glyphosate resistance Only the epsps gene was re-amplified by using primers corresponding N-terminus and C-teminus of EPSPS protein, and 1.7 Kb of the amplified product was recovered. The amplified epsps gene was digested with NdeI and SalI restriction enzyme, and introduced in-pET28(a) plasmid, an expression vector for Escherichia coli, to construct pET28(a)-GM plasmid, and then transformed into E. coli BL21(DE3) host cell. During the fermentation of this recombinant strain in LB broth, it was found that the maximal productivity of EPSPS protein was achieved when cultivating 3∼4 hrs after supplementing 1 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyrranoside (IPfG) as an inducer for gene expression in 2 hr-culture broth The produced EPSPS protein was found in insoluble part of inclusion body. Thus the cultivated E. coli cells was ultrasonicated and the EPSPS protein was extracted from the inclusion body by 6 M urea. The EPSPS protein was then purified from 6M area extract through immobilized nickel-affinity column chromatography. A single peak was observed when eluting with elute buffer, and this faction showed a single band at 57 kDa on 10% SDS-PAGE. It implies that the recombinant epsps gene was well expressed to EPSPS protein When the purified EPSPS protein was subjected to simulated gastric fluid (SGF) containing pepsin at pH 1.5, the protein was completely digested within 1 min, which mans that EPSPS protein in GM soybean could not show any allergenicity by completedestruction in gastrointestinal tract when administered orallyFurther, the passive cutaneous anaphylaxis reaction of the purified EPSPS protein in rat system was attempted. For this, rat wasdivided into two groups; one for oral administration and the other for subcutaneous administration. Each groups was sensitizedwith 0.5 and 2mg/kg of EPSPS protein 3 times a week for 3 weeks. Any significant differences in body weight change andgeneral symptom was not found during administration. One week later after last boosting, the rat serum will be separated anddiluted to 1/2∼1/256, and then injected intradermally on the clipped back of unsensitized rats. The allergenicity of EPSPS proteinwas examined by the degree of Evans blue when EPSPS protein with 1% Evans blue was challenged intravenously after 48hrof serum injection. Any positive results showing the immunoglobulin E (IgE0-specific release of Evans blue were not observedin both groups of oral administration and subcutaneous administrationUsing mast cells from Sprague Dawley rat sensitized orally with 0, 5 or 20mg/kg of EPSPS protein 3 times a week for 3 weeks, ex vivoallergenicity was also examined by treating the sensitized mast cells with 10μg/ml of EPSPS protein. During the exposure on theantigen, the sensitized mast cells did not increase the release of histamine and cytokine (tumor necrosis factor-α (TNF-α) andinterleukin-4 (IL-4)) compared to the unsensitized control onesThe in vitro allergenicity test in mast cell culture from the unsensitized Sprague Dawley rat was also tried. When the unsensitizedmast cells was labelled for 16 hrs with rat antiserum collected after sensitization with 0, 0.5 or 2mg/kg of EPSPS protein,any significant differences in the release of histamine and cytokine (TNF-α and IL-4) compared to unlabelled mast cellsFrom the above results, it could concluded that the recombinant EPSPS protein in GM soybean did not elicit any high allergenicitynor antigenicity within the dosage amount of soybean consumption
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