초록 ▼

최종 연구개발목표
. 함박꽃나무 및 치거리에서 costunolide와 magnolialide의 분리 및 천연물에서 sesquiterpene lactone계 화합물 분리
·Costunolide와 magnolialide를 모핵 화합물로 다양한 in vitro검색기법을 사용하여 선택적 항암작용이 있는 화합물을 선정한 후 in vivo 항암 작용을 확인함.
. 가장 우수한 항암작용 화합물 및 유도체를 합성하여 in vitro 및 in vivo 검색기법을 사용하여 선도물질을 도출
연구방법 및 결과
1.Cost

최종 연구개발목표
. 함박꽃나무 및 치거리에서 costunolide와 magnolialide의 분리 및 천연물에서 sesquiterpene lactone계 화합물 분리
·Costunolide와 magnolialide를 모핵 화합물로 다양한 in vitro검색기법을 사용하여 선택적 항암작용이 있는 화합물을 선정한 후 in vivo 항암 작용을 확인함.
. 가장 우수한 항암작용 화합물 및 유도체를 합성하여 in vitro 및 in vivo 검색기법을 사용하여 선도물질을 도출
연구방법 및 결과
1.Costunolide
(1)분리
함박꽂 나무 수피에서 cyclic monoterpene and costunolide의 분리
(2)분화유도
Cogtunolide는 in vitro에서 농도 의존적으로 강력한 항종양 활성을 나타내나 200μM의 높은 농도에서도 정상 Macaccus rheus 원숭이 신장세포(MA-104)에서는 세포독성이 나타나지 않았다.
Costunolide는 CDl4, CD66b 표면 항원의 발현, NBT의 환원 능력, esterase 활성정도 및 형태학적 관찰등의 평가로서 사람 백혈병 유도 HL-60 cell의 분화에 있어 효과적인 inducer임을 밝혔다.
분화 유도와 동시에 c-myc 단백질의 발현이 감소가 동시에 일어나고 있다.
(3)Apotosis 유도 작용
Costunolide가 HL-60 백혈병세포에서 세포사멸을 유도한다.
Apoptosis유도작용과 ROS와의 연관성을 DCFH-DA를 사용하여 확인하였으며, 항산화제인 N-acetyl-L-cystein을 전처리하면 apoptosis 유도작용이 감소됨을 확인하였다.
ROS는 mitochondrial membrane potential과의 상관성을 rhodamine 123를 사용함으로서 확인하였다.
Cytochrome c가 cytosol로 유리가 증가되며 caspase 9, 3이 활성화되었다.
(4)Costunolide Exomethylene Group이 세포내 glutathion과 결합에 의한 apoptosis 유도
Costunolide는 신속하게 농도 및 시간 의존적으로 세포내 GSH 및 thiols 단백질을 제거
exomethylene의 functional기를 찾기 위하여 costunolide 유도체들인 dihydrocostunolide 와 saussurea lactone을 합성하였으며 이들 화합물에서는 apoptosis유도 작용이 관찰되지 않음으로 exomethylene기가 생리 활성에서 중요한 moiety임을 확인.
(5)costunolide 유도 apoptosis에서 JNK 활성이 요구됨
costunolide 유도 apoptosis는 Bcl-2 overexpressed된 세포플에서 완전히 apoptosi가 억제됨으로서 costunolide 유도 apoptosis는 Bcl-2와의 상관성을 확인하였다.
costunolide유도 apoptosis에서 MAP kinase의 하나인 c-Jun N-terminal Kinase가 관련되어 있음을 transdominant-negative c-jun세포에서 apoptosis가 blocking됨으서 확인하였다.
NAC 전처리시 costunolide의 JNK 활성 증가가 완전히 저해됨으로서 ROS가 JNK의 upstream으로써 JNK의 활성에 영향을 주는 것을 확인하였다.
Bcl-2 overexpression cell에 costunolide 처리시 vector만 들어가 있는 대조군 세포에서 처리하는 것과 같은 JNK의 활성을 나타냄으로서 Bcl-2의 overexpression이 JNK의 활성에 영향을 주지 못한 것으로 보아서 JNK는 Bcl-2의 upstream으로 추정된다.
(6)In vivo anti-tumor activity
In vivo 실험에서 costunolide (15, 30㎎/㎏, i.p.) 투여시 3LL Lewis lung carcinoma를 함유한 CDFI mice의 뚜렷한 생명연장과 tumor size 감소를 확인하며 이는 대조 약물인 cisplatin (4 mg/kg, i.p.)과 유사한 작용을 나타내었다.
2. Magnolialide
(1)분리
치커리 잎에서 분화 유도 물질인 magnolialide (1β-Hydroxy eudesmanolide) 와 artesin의 분리
(2)분화유도작용
Magnolialide는 여러 암세포주 성장에 대한 강한 저해 작용이 있었다.
백혈병 세포주인 HL-60및 U-937세포를 monocyte/macrophage로 분화시킨다.
1β-hydroxyeudesmanolide인 artesin은 분화유도작용이 관찰되지 않았다.
3. Intermedeol의 분화유도작용
·Intermedeol은 HL-60세포의 강한 성장억제 작용을 보였다.
nitroblue tetrazolium reduction test, esterase activity assay, phagocytic activity assay, morphology change, and expression of CDl4 and CD66b surface antigens에의해 monocyte 및 granulocyte로의 분화유도작용을 확인
p-21의 증가 및 c-myc단백질 감소에 따른 신호전달기전으로 밝혀짐

Abstract ▼

1.Costunolide
(1)Isolation
$\cdot$a novel acyclic monoterpene named deoxygeraniol was isolated along with β -sitosterol 3-0-linoleate. trillnolein and high amount of costunolide in the pure state.
(2)Differentiation
$\cdot$Costunolide produced a potent antitumor

1.Costunolide
(1)Isolation
$\cdot$a novel acyclic monoterpene named deoxygeraniol was isolated along with β -sitosterol 3-0-linoleate. trillnolein and high amount of costunolide in the pure state.
(2)Differentiation
$\cdot$Costunolide produced a potent antitumor activity in vitro against several tumor cells
$\cdot$Costunolide was found to be a potent inducer of differentiation in human leukemia derived HL-60 cells by examination of differentiation marker, as assessed by reduction of nitroblue tetrazolium (NBT), increase in esterase activities and phargocytic activity, morphology change and expression of CDl4 and CD66b surface antigens.
$\cdot$These events were accompanied by a decline in expression of the c-myc protein
(3)Apoptosis
$\cdot$Costvnolide is a potent inducer of apoptosis and facilitates its activity via ROS generation, thereby inducing mitochondrial permeability transition (MPT) and cytochrome c release to the cytosol. ROS production and mitochondrial alteration
$\cdot$apoptotic cell death in costunolide-treated cells was blocked by the antioxidant N-acetyl-L-cystein (NAC).
(4)Costunolide Triggers Apoptosis in Human Leukemia U937 cells by Depleting Intracellular Thiols
$\cdot$Costunolide treatment rapidly depleted the intracellular reduced glutathione (GSH) and protein thiols, and this preceded the occurrence of apoptosis.
$\cdot$Treatment with sulfhydryl compounds such as the reduced glutathione. N-acetyl-L-cystein, dithiothreiotil and 2-mercaptoethanol almost completely blocked the costunolide-induced apoptosis. highlighting the significance of the intracellular thiol level in the precess.
$\cdot$overexpression of Bcl-2 also significantly attenuated the effects of costunolide
(5)Requirement for JNK activation in costunolide-induced apoptosis
$\cdot$JNK activation by costunolide contributed to apoptosis because transdominant-negative JNK significantly blocked costunolide-induced cell death. 2. Differentiation-Inducing Effect of magnolialide, a 1-Hydroxyeudesmanolide isolated from Cichorium intybus, on Human Leukemia Cells $\cdot$we isolated two 1-hydroxyeudesmanolides. Cichorium intybus contains two 1-Hydroxyudesmanolide. magnolialide and artesin, together with several constituents. $\cdot$Magnolialide inhibited the growth of several tumor cell lines and appeared to induce differentiation of human leukemia HL-60 and U-937 cells to monocytes/macrophage-like cells. Another 1-Hydroxyeudesmanolide, artesin. and other constituents were inactive. 3. Intermedeol isolated from the leaves of Ligularia fischeri val. spiciformis Induces the Differentiation of Human Acute Promyeocytic Leukemia HL-60 Cells $\cdot$Intermedeol exhibited a potent antiproliferative activity against HL-60 cells. $\cdot$a potent inducer for HL-60 cell differentiation as assessed by nitroblue tetrazolium reduction test, esterase activity assay, phagocytic activity assay, morphology change, and expression of CDl4 and CD66b surface antigens. $\cdot$the expression level of c-myc was down-regulated during intermedeol-dependent HL-60 cell differentiation, whereas p21CIPl was up-regulated.

목차 Contents

• 표지 ...1
• 제출문 ...2
• 목차 ...3
• 연구개발사업 최종보고서 요약문 ...4
• Project Summery ...6
• Ⅱ. 총괄연구개발과제 연구결과...8
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...8
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...9
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...18
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...19
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획...21
• 6. 첨부서류...21