보고서 정보
주관연구기관 |
서울대학교 Seoul National University |
연구책임자 |
박동은
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발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2002-05 |
주관부처 |
보건복지부 |
사업 관리 기관 |
서울대학교 Seoul National University |
등록번호 |
TRKO200300001542 |
DB 구축일자 |
2013-04-18
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키워드 |
분비기작.아미노말단 프로세싱.세포외기질.단백질분해효소.전이.secretory mechanism.N-terminal processing.extracelluar matrix.pretense.metastasis.
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초록
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연구목적:
암의 전이과정에서 종양의 주위를 둘러싸고 있는 기질부위 (stromal compartment)의 기저막(basement membrane)을 분해하는 효소로서는 금속성 이온 의존적인 rnotalloprotease인 type-Ⅳ collagenases (MMPs)와 serlrle pretense인 urokinase-type plaminogen activator (uPA)가 잘 알려져 있으며, 이들은 암종에서 과발현 되는 양상이 보고되어 있어 암종에서의 중요한 역할을 추정할 수 있다. Epithin은 최근에 본 실험실
연구목적:
암의 전이과정에서 종양의 주위를 둘러싸고 있는 기질부위 (stromal compartment)의 기저막(basement membrane)을 분해하는 효소로서는 금속성 이온 의존적인 rnotalloprotease인 type-Ⅳ collagenases (MMPs)와 serlrle pretense인 urokinase-type plaminogen activator (uPA)가 잘 알려져 있으며, 이들은 암종에서 과발현 되는 양상이 보고되어 있어 암종에서의 중요한 역할을 추정할 수 있다. Epithin은 최근에 본 실험실의 연구로 알려진 단백질분해효소로, uPA와 같은 serine protease이며 호르몬 비의존적이 아닌 호르몬 의존적인 유방암 세포주들에서만 발현되며, 젖과 같은 체액으로 분비됨이 알려져 있다. 또한 Epithin은 효소활성부위가 세포막외부에 존재하는 막단백질로 collagen과 같은 세포외기질 단백질들을 분해함으로써 암의 침투 및 전이과정에서 중요한 역할을 할 것으로 추정된다. 따라서 본 연구진은 다음과 같은 목표를 가지고 연구를 수행하였다.
1. Epithin의 분자적, 생화학적 특성연구
2. Epithin의 분비 조절기전
3. Epithin의 기능성 부위에 상호 결합하는 결합인자 동정
4. 세포의 침투 및 전이과정에서 Epithin의 기능
연구 방법 및 결과:
Epithin은 high-mannose type의 glycoprotein으로 발현되며 Processing에 의해 Epi-5와 N-말 단 fragment로 분리되나, Epi-S는 세포밖으로 분비되지 않고 transmembrane region이 존재하는 N-말단 fragment와의 결합을 통해 세포막에 위치하였다. 이러한 과정은 Epithin의 $G^149$를 N으로 치환한 mutant떼서는 관찰되지 않았음으로 $G^149$가 Epithin의 processing과 release에 중요한 부위임을 알 수 있었다. 이후 serine pretense inhibitor인 ecotin에 의해 저해되는 unknown serine pretense얘 의해 cleavage가 일어나 최종적으로 Epithi 의 secretion이 이루어짐을 밝혀내었다. Epithin의 pretense 기능이 없는 mutant의 경우에는 분비가 억제됨을 관찰하였기 때문에 ecotin에 의해 해되는, Epith조의 분비에 관여하는 serine pretense는 Epithin 자신일 수 있음을 증명하였다.
효모 two hybrid 법으로 Epithin의 세포내부위에 결합하는 단백질을 검색한 결과 actin 단백질의 cross-linker로 알려진 filamin이 동정되었고, actin cytoskeleton을 붕괴시키는 cytochalasinD의 처리에 의해 Epithin의 release가 유도되었으므로 세포골격근과의 상호작용을 통해 Epithin의 기능이 조절될 가능성을 보였다.
암세포가 성장하기 위해 주위에 있는 혈관내피세포들의 이동을 촉진시키는 과정에서 urokinase type plaminogen activator (uPA)나 mstrix-metalloprotease의 역할은 필수적이다. 이미 보고된 바와 같이 Epithin은 uPA를 활성화시킬 수 있으므로 이러한 과정에서 분비된 Epithin이 혈관형성과정에 촉진하는 것을 살펴보고자, Epithin의 분비를 유도하고 배지를 혈관 내피세포들에 처리하였을 때, 대조군에 비해 혈관형성이 6시간 정도 앞당겨지는 것을 관찰하였다. 이는 Epithin이 혈관형성을 증가시킬 수 있다고 보고된 여러 단백질 분해효소들의 cascade에 존재함을 간접적으로 시사하고 있으며 Epithin이 암세포 성장 억제제 개발의 target이 될 수 있음을 보여주고 있다.
Epithin의 분자적, 생화학적 특성, 분비 조절기전, 결합인자 동정, 혈관형성과정에서 Epithin에 역할 등에 대한 지금까지의 연구는 암세포에서 단백질 분해효소?의 성장을 막는 치료제의 개발에 기초를 제공할 수 있을 것으로 사료된다.
Abstract
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Purpose:
In tumor metastasis, proteases are required for degradation of basement membrane that are the barrier for cancer cells to migrate. Type-Ⅳ collagenases and urokinase-type plaminogen activator (uPA) are known to be overexuessed in cancer tissues, which suggest these pretense have importan
Purpose:
In tumor metastasis, proteases are required for degradation of basement membrane that are the barrier for cancer cells to migrate. Type-Ⅳ collagenases and urokinase-type plaminogen activator (uPA) are known to be overexuessed in cancer tissues, which suggest these pretense have important roles in tumor metastasis. We reported the cloning of a mouse type Ⅱ membrane serine protease, Epithin. The human orthologues of Epithin was cloned later and reported to be expressed in hormone-dependent breast cancer cells and to be secreted into body fluids such as milk. Epithin is also known to play important roles in cancer cell invasion and metastasis by degrading extracellular matrix, collagen. Here, we studied the function of Epithin with following specific aims.
1. Identification of molecular and biochemical properties of Epithin
2. Study of secretion mechanism of Epithin
3. Identification of interaction proteins of Epithin
4. Elucidation of function of Epithin in cancer cell invasion and metastasis
Results:
Epithin was expressed as high-mannose type glycoprotein, and processed into two fragments, Epi-S and N-terminal fragment, which interact together. Epi-S was found on the cell suface, where it was anchored by the H-terminal fragment. Using site-directed mutagenesis experiments, we identified Gly149 of the GSVIA sequence in Epithin as required for the processing and release of the protein. Secretion of Epithin was blocked by Ecotin, the serine pretense inhibitor, which means unknown serine pretense is responsible for second cleavage required for secretion of Epithin. Mutation of ser850 that is necessary for serine pretense activity, resulted in absence of secreted Epitnn. Therefore Epithin could be involved in secretion of itself.
Actin cross linker, filamin B, was identified as Epithin cytoplamic tail interacting protein in yeast two hybrid assay. In addition, as the destruction of actin cytoskeleton by cytochalasin D treatment induced the release of Epithin, actin cytoskeleton may modulate function of Epithin via filamin.
Cancer cells were known to induce the formation of new blood vessels from parent vessels for their survival, and urokinase type plasminogen activatnr (uPA) and matrix-metalloprotease (MMP) may have critical roles in this process by degradation of extracellular matrix, facilitating movement of endothelial cells. As Epithin could activate uPA, we tested if Epithin may be involved in angiogenesis by initiating other protease activation cascades through activation of uPA, We observed microvessel-like tube formation by human umbilical vein endothelial cells was enhanced by Epithin treatment This study suggests that Epithin could be involved in ntease cascades that are responsible for angiogenesis and may one of specific target molecules for cancer growth inhibitors.
Study of molecular and biochemical properties, secretion mechanism, interacting proteins, and functions in cancer cell invasion and metastasis of Epithin will provide the propound understanding of interaction of extracellular proteases and their functions in cancer, and also basic knowledge for drug discovery for cancer treatment.
목차 Contents
- I. 연구개발결과 요약문...4
- (한글) 유방암의 전이과정에서 세포외기질 분해효소 Epithin의 기능연구...4
- (영문) Role of serine protease Epithin in breast tumor metastasis...6
- II. 총괄연구개발과제 연구결과...8
- 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...8
- 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...9
- 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...16
- 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...18
- 5. 총괄연구개발과제의 활용계획...20
- 6. 첨부서류...21
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