초록 ▼

현장측정 (Point-of-care testing; POCT)이 임상 분야에서 보편화 되가면서 정확하고 경제적이며 편리한 dry chemistry strip이 요구되고 있을 뿐 아니라, 휴대용 측정기의 사용 또한 증가되고 있다. 그러한 요구에 부합하여 전류법을 이용한 전기화학 센서가 POCT 분야에서 널리 사용되어져 왔는데, 이 방법은 작은 분자량의 대사물질 (글루코우즈, 락테이트, 콜레스테롤)을 정량적으로 분석하는 데 여러 정보를 제공하고 있다. 효소를 신호 발생 물질로 이용한 효소면역분석법 또한 항원-항체 사이의 강한 면역 특이

현장측정 (Point-of-care testing; POCT)이 임상 분야에서 보편화 되가면서 정확하고 경제적이며 편리한 dry chemistry strip이 요구되고 있을 뿐 아니라, 휴대용 측정기의 사용 또한 증가되고 있다. 그러한 요구에 부합하여 전류법을 이용한 전기화학 센서가 POCT 분야에서 널리 사용되어져 왔는데, 이 방법은 작은 분자량의 대사물질 (글루코우즈, 락테이트, 콜레스테롤)을 정량적으로 분석하는 데 여러 정보를 제공하고 있다. 효소를 신호 발생 물질로 이용한 효소면역분석법 또한 항원-항체 사이의 강한 면역 특이 인식력에 바탕을 두고 있기 때문에 생체 내 또는 복잡한 혼합용액안에서 선택적으로 특정 물질을 정량할 수 있는 분석법으로 널리 사용되고 있다. 본 연구팀은 이러한 효소면역분석법과 전기화학 검출법을 결합시킴으로써 염증성 질환 표지 물질인 CRP (C-Reactive Protein)를 쉽고 빠르게 측정할 수 있는 면역센서 시스템을 개발하고자 하였다. CRP는 급성 염증이나 급성의 조직붕괴로 체내에서 증가하는 단백질로 acute phase protein으로 불린다. 현재까지 혈중 CRP의 측정법으로는 모세관법 / 면역비탁법 / 라텍스응집 광학측정법 등이 있으며, 주로 염증, 조직장해를 일으키는 여러 가지 질환의 활동성, 중상도, 경과 관찰 및 예후 판정에 매우 유용한 단백질이다. 최근 들어서는 High Sensitive CRP 검사의 개념이 도입되면서 연구가 활발히 진행되고 있다. 이것은 심근 경색의 risk factor로서 0.001 mg/ml 이하에서의 정확한 측정을 요구한다. 본 연구의 개념은 작동전극 및 항체의 고정화를 위한 고체상으로 다공성 gold 전극의 사용에 기초하고 있다. 다공성 gold 전극은 침착 (sputtering) 기술을 이용하여 제작되며, 다공성 gold 전극에 항체를 고정시키고 고안된 cell에 장착한 뒤 전극면에 고정된 항체의 결합자리에 대하여 분석물질과 분석물질-효소 접합체 간의 경쟁결합을 유도한다. 그 후 일정 전위를 걸어주고, 전극의 뒷면에서 기질을 가하면 전극 내의 홀을 통해 확산된 기질은 전극표면에 형성된 효소층에서 신호전달 물질로 변화되고 산화반응을 통해 전기적 신호를 내게된다. 따라서 전극면에 형성되는 효소표지의 양에 따라 기질 반응속도에 영향을 주고, 이 때 효소표지의 양은 분석물질의 농도에 관계된다. 즉 분석물질의 양이 많은 경우, 한정된 양의 결합자리에 대하여 분석물질-효소 접합체의 면역결합 정도는 감소하게 되고 전극부위의 효소표지 양이 감소한다. 따라서 막의 뒤쪽에서 일정한 속도로 확산되는 기질의 반응속도가 감소하게 되고 전기적 신호의 크기도 작게된다. 반면 분석물질의 양이 적은 경우, 경쟁하는 분석물질-효소 접합체의 양이 증가하여 큰 신호를 내게된다. 신호는 전극의 뒷면에서 가한 기질이 전극내의 공극을 통해 들어오면 표면에 결합된 효소 접합체와 기질-효소 반응을 통해 생성된 산화 및 환원 물질을 전기화학 반응을 통해 검출하게 된다. 면역 반응 후 결합되지 않은 효소 접합체는 인위적으로 분리하지는 알지만 기질의 확산에 의해 전극 표면으로부터 구분되어진다. 분석물질-효소 접합체와 기질은 glass fiber 패드를 이용하여 loading되며, 다공성 gold 전극의 양면으로 붙여 sandwich식으로 만들었다. 우선 다공성 gold 전극에 CRP 항체를 고정시킨 후 CRP-ALP (Alkaline phosphatase) 접합체를 위 패드에 적하하여 준비해놓고, CRP 표준용액을 0.1 - 1000 ng/ml 농도별로 넣어 고정된 항체에 대하여 경쟁반응 시켰다. 10분의 면역반응 후에 기질인 p-aminophenyl phosphate를 뒤 패드로 주입하게 되면 나일론의 공극을 통하여 기질이 확산하게 되고, 그 후 전극에 150 mV를 적용시켜 주면 CRP 농도별로 다른 전류값을 얻게 된다. 이 과정을 통하여 표준용액 농도 1 - 1000 ng/ml 범위에서 CRP를 검출할 수 있었다. 혈청 내에 존재하는 CRP에 대 혈중 CRP 측정방법인 ELISA 방법을 통해 CRP 검정선을 작성하여 비교한 결과 1 - 1000 ng/ml 범위에서 검정선을 얻을 수 있었으며 본 연구에서 개발한 면역센서와 기존의 방법인 ELISA와 비교하여 볼 때, 본 센서는 우수한 성능을 가졌으며 앞으로의 지속적인 개발을 통하여 상품화 가능성이 충분하다고 볼 수 있다.

Abstract ▼

As the point-of-care testing (POCT) becomes popular in clinical field, the demand for accurate, economic, and convenient dry chemistry strips and their portable reading devices have dramatically increased. Amperometric electrochemical sensors that meet such demands have been widely used in POCT envi

As the point-of-care testing (POCT) becomes popular in clinical field, the demand for accurate, economic, and convenient dry chemistry strips and their portable reading devices have dramatically increased. Amperometric electrochemical sensors that meet such demands have been widely used in POCT environment, providing quantitative information for small metabolites (e.g., glucose, lactate, and cholesterol), Enzyme immunoassay (EIA) methods that employs enzymes linked to an antigen or antibody as a signal generating material, and an antibody as a highly specific binding recognition material for a target antigen are also widely used in the biomedical analysis of complex physiological samples; the method. In this project, we proposed to make an immunoassay sensor system that can accurately determine the C-Reactive Protein (CRP), a marker for inflamatory reaction m human body, fast and easy by hybridizing the method with electrochemical detection scheme. CRP, which increases sharply in the patients with inflammation or neoplastic proliferation, is often called acute phase protein. This protein is usually measured by capillary method, immunoturbidometry, and optical detection of aggregated latex particles. Recently, there are increasing research activities in the development of high sensitive CRP (hsCRP) determination. The detection level of CRP should be lower than 0.001 mg/mL when it is used as a risk factor for myocardial infraction. To make a hsCRP sensor, we employed a microporous gold electrode. The double-sided microporous gold electrodes were formed on a porous nylon membrane, and antibodies were immobilized on them. The antibody-immobilized electrodes were then sandwiched between the two covers with a hole on the electrode site. Competitive EIA was carried out on the antibody immobilized working electrode surface, and a constant potential was applied while the substrate was added to the counter electrode side and diffused to the working electrode through micro pores; the electron transfer reaction on the working electrode surface generate electrical currents which are inversely proportional to the concentration of analyte. This method provides distinctive advantages over conventional EIA method in that it does not require wash-separation steps. In order to make a disposable dry chemistry EIA strip with the double-sided microporous electrode, enzyme-analyte conjugate and substrate were dried in two glass fiber pads and they were affixed on the working and counter electrodes, respectively. The CRP sensor was fabricated as follows: (1) anti-CRP was immobilized on the microporous on the microporous working electrode; (B) CRP-ALP (alkaline phosphatase) conjugate was added to the glass fiber pad and dried; (3) the CRP-ALP containing pad was affixed on the working electrode and a blank glass fiber pad on the counter electrode.Dropping standard solutions of 0.1 - 1000 ng/mL CRP on the CRP-ALP containing pad, competitive reactions were allowed to proceed on the anti-CRP immobilized working electrode for 10 min. of incubation period. The substrate p-aminophenyl phosphate was applied to the blank pad on counter electrode and +150 mV of potential was applied to obtain chronoamperometric responses. The dose-current response curve showed that the detection range of the CRP sensor was 1 - 100 ng/mL. Further optimization of the sensor with serum samples resulted in a detection range in the 100 - 1000 ng/mL. The sensitivity and deletion range of the electrochemical immunoassay sensor were comparable to those of conventional ELISA method. The final results show that the sensor developed through this project may become potent commercial product in near future.

목차 Contents

• II. 총괄연구개발과제 연구결과...8
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...8
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법...12
• 3. 총괄연구개발과제의 연구개발 결과...23
• 4. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...36
• 5. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...37
• 6. 총괄연구개발과제의 활용계획...38
• 7. 첨부서류...40