초록 ▼

1. 본 연구의 목적 및 범위
1) 항바이러스 활성을 가진 천연물 항암물질 개발을 위한 선도물질 창출
2) 난소암 및 자궁암 세포와 생체내ㆍ외 항암활성 assay 계를 활용하여 천연물로부터 항암제 개발을 위한 선도물질 및 후보물질을 도출하여 신약개발 가능성 타진
ⅰ) 난소암 세포주 (SK-OV-3, NIH-OV-CAR-3), 자궁암 세포주 (SiHa, HeLa), 유방암 세포주 (MCF-7)들을 이용하여 in vitro에서 활성이 있는 새로운 물질을 계속적으로 탐색
ⅱ) Nude mouse를 이용한 in viv

1. 본 연구의 목적 및 범위
1) 항바이러스 활성을 가진 천연물 항암물질 개발을 위한 선도물질 창출
2) 난소암 및 자궁암 세포와 생체내ㆍ외 항암활성 assay 계를 활용하여 천연물로부터 항암제 개발을 위한 선도물질 및 후보물질을 도출하여 신약개발 가능성 타진
ⅰ) 난소암 세포주 (SK-OV-3, NIH-OV-CAR-3), 자궁암 세포주 (SiHa, HeLa), 유방암 세포주 (MCF-7)들을 이용하여 in vitro에서 활성이 있는 새로운 물질을 계속적으로 탐색
ⅱ) Nude mouse를 이용한 in vivo에서의 항암활성 탐색으로 새로운 항암제 개발을 위한 선도물질 및 후보물질 도출
3) 기존의 항암제와의 항암복합요법의 시도로 새로운 복합항암요법의 개발
4) 난소암 연구를 위한 in vitro 및 in vivo 실험법의 확립과 이를 이용한 다른 여러 암 연구의 기본 인프라 구축
5) 난소암 환자의 임상적 치료효과 상승
이들 연구를 통하여 최종적으로
- 천연물로부터 기존항암제 (예, 택솔, 시스플라틴)와는 다른 작용기전이 기대되는 항암활성 (난소암, 자궁경부암, 유방암) 선도물질 창출
- 천연물로부터 기존항암제 (예, 택솔, 시스플라틴)와의 병용투여로 상승효과 기대 가능한 선도물질 개발
- 천연물로부터 기존항암제 (예, 택솔, 시스플라틴)의 부작용 예방 가능한 선도물질 개발에 기여함을 목적으로 하였다.
2. 연구방법 및 연구결과
1) 바이러스 성장억제 혹은 암세포에 대한 cytotoxicity 활성물질의 탐색, 분리, 구조결정
a) 바이러스 성장 억제활성 탐색결과 총 202종 생약 중에서 113 Shope Fibroma Virus (SFV) 성장억제활성이 인정된 천연물 추출물 18종 대하여 human 암세포 (SK-OV-3, SiHa) 살해능 검색결과 cytotoxicity가 높게 나타났다. (10 ㎍/ml 농도에서 30％이상 inhibition을 나타낸 생약, 각각 14종) 그 중 활성성분 정제대상으로 선정된 생약 AS-7에 대하여 in vitro에서 토끼신장세포 배양액에서의 SFV 성장에 의한 cytopathic effect를 저해하는 활성을 추적하였다. 동시에 SK-OV-3 (난소암), NIH-OV-CAR-3 (난소암), SiHa (자궁암), MCF-7 (유방암) 등의 4가지 부인암세포에 대한 cytotoxicity 활성을 기준으로 그 활성성분을 추적하였다. 즉, AS-7 생약의 에테르 분획을 유기용매를 이용한 반복적인 실리카겔 컬럼 크로마토그라피법을 사용하여 mineral oil 계통의 화합물, compound A (80 ㎎)를 순수분리 하였으며, SK-OV-3에서 LDH assay에 의한 cytotoxicity가 강하게 관찰되었다. ($IC_{50}$=3.52 ㎍/ml)
b) 목련과 식물에서 분리한 화합물, magnolol, honokiol과 분획물들에 대하여 SK-OV-3, SiHa, HeLa cell을 대상으로 cytotoxicity를 측정한 결과 거의 모두 활성이 관찰되었다.
c) Ginsenoside Rg3 및 생약 AS193의 유효활성 분획 RKG에 대하여 LDH assay와 MTT assay에 의한 cytotoxicity를 측정한 결과 Rg3 및 RKG15 모두 ㎍/㎖ 수준에서 강한 활성을 나타내었다.
2) 생약, 분획, 혹은 단리된 화합물에 대하여 apoptosis 유도
a) AS-7 생약의 메탄올추출물이 항 바이러스활성 및 사람의 암세포에 cytotoxicity를 나타내는 것이 밝혀졌으므로 이 추출물의 활성물질이 apoptosis를 유도하는지의 여부를 밝히기 위하여 SK-OV-3 세포를 6 well plate에서 5 × 10⁴ cells/well을 가하여 24시간 배양한 후 AS-7 추출물 20 ㎍/ml을 가하여 24시간 동안 배양한 후, Propodium Iodide와 Annexine V를 첨가하여 double staining을 시행한 후 유세포 분석기를 이용하여 apoptosis 유도효과를 관찰한 결과?합물인 Compound A에 대하여 apoptosis 유도효과를 관찰한 결과 compound A는 apoptosis 유도효과가 없음을 확인하였다.
c) 목련과 식물에서 분리한 화합물, magnolol, honokiol을 비롯한, YK-et 등에 대하여도 apoptosis 유도 활성을 관찰하였다.
d) Ginsenoside Rg3 및 생약 AS193의 유효활성 분획 RKG15에 대하여 apoptosis 유도 활성을 검색한 결과, Rg3는 early stage of apoptosis를 유도하는 활성이 없었으며, 반면에 RKG15는 10.29％로 control (5.25％)에 비해 약 2배의 apoptosis 유도효과가 있음이 관찰되었다. 또한 유효활성 분획 GKG15을 정제한 RKG15-1, 2분획 중 RKG15-1 (11.87％)은 control (5.7％)에 비해 약 2배, RKG15-2 (19.57％)은 약 3.5배의 apoptosis 유도효과가 있음이 관찰되었다. (Fig. 7, Table Ⅶ)
3) 기존 항암제, Taxol의 apoptosis 유도능과 기전 연구
a) Annexin V-FITC와 Propidium iodide (Pl)를 이용하여 Taxol에 의한 apoptosis의 type을 결정하였다. 5 μM 농도에서 primary apoptosis (or early apoptosis)와 secondary apoposis (late apoptosis or necrotic cell death)가 각각 관찰 되었으며, 정상 세포에 비하여 apoptosis rate가 5배 이상 증가하였다.
b) 핵상의 변화를 확인하기 위해 PI로 염색 후 유세포 분석기를 이용하여 DNA 분절화 및 세포 주기 변화 측정하였다. Taxol 처리 후 절반 이상의 세포에서 G2-M arrest가 나타났으며, Sub-Gl(Fragmemted DNA) 역시 2배 이상 증가하였다.
c) Dual emission wavelength의 성질을 가진 lipophilic cationic fluorescence dye인 JC-1을 사용하여 미토콘드리아 막전위차의 변화를 측정한 결과, taxol을 처리한 세포에서 2배 이상의 막전위차의 감소를 관찰하였다.
d) 반응성 산소족은 apoptosis를 일으키는 원인의 하나로 알려져 있으나, taxol을 처리한 이후 발생되는 반응성 산소족(H₂O₂)의 양은 정상 세포와 차이가 없었다.
e) Western blotting을 이용하여 난소암세포에서의 5 μM의 taxol 농도에서 Bcl-2의 인산화는 확인하였으나, 대표적인 apoptotic factor인 caspase-3는 활성되지 않는 것을 확인하였다. 이는 난소암에서는 기존에 알려진 caspase를 통한 apoptosis와는 다른 기전을 가짐을 의미한다고 볼 수 있다.
f) AIF (apoptosis inducing factor)라고 알려진 단백질은 미토콘드리아에 존재하다, 미토콘드리아의 막전위가 감소하면 세포질로 방출된 후, 핵으로 이동하여 DNA를 large-scale(>50kb)로 절단한다고 알려져 있다. 이에 난소암세포에 taxol을 처리하여 apoptosis는 유도하였으나, 보다 그 정확한 기전을 확인하기 위해 Confocal microscope을 이용하여 AIF의 위치변화를 관찰하였으며, AIE가 세포질에서 핵으로 이동한는 것이 관찰되었다. 이는 난소암세포에서, Taxol 처리 후, 발생하는 apoptosis가 caspase에는 독립적이며, AIE 의존적임을 의미한다고 볼 수 있다.
4) 동물 실험법 수립 및 이를 이용한 in viuo 항암활성 측정
a) 단리된 활성물질에 대하여 in vivo에서의 항암활성 검토를 위하여 1차 년도에 동물 실험법을 수립하기 위한 예비실험을 시도하였다. 즉, Nude mice (Balb/c) 21마리를 대상으로 (control 11마리, AS-193 10마리) 사람 간암세포인 SK-Hep-1 cell을 2 × $10^7$ cells/0.2 ml RPMI/mouse로 쥐의 옆구리에 피하주사 한 후 생존기간과 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과 생약 AS-193을 100 ㎎/㎏ 로 일주일에 2회씩 경구 투여한 군은 생존기간에? 현저히 저해하는 것을 확인할 수 있었다.
b) 1차 년도에 실시한 예비실험에 이어 2차 년도에는 사람의 부인암세포인 SKOV-3를 nude mice 에 접종하고 생약 AS193 추출물을 경구투여 하여 생약 A193의 in vivo 항암활성을 측정하였다. 즉, Nude mice (Balb/c) 40마리를 대상으로 (control군, AS-193 단독투여 군, CDDP 단독투여군, AS193＋CDDP 병용투여 군 등 각 군당 10마리) SKOV-3 cell을 5 × $10^6$ cells/0.2 ml RPMI/mouse로 쥐의 옆구리에 피하주사 한 후 생존기간과 종양의 크기를 측정하였다. 그 결과 생약 AS-193을 100 ㎎/㎏ 로 일주일에 3회씩 경구 투여한 군은 종양성장억제효과가 우수하였고 (27.8％), 생존기간 연장효과 또한 매우 우수하였다. (31.0％)
5) 현재 임상에서 항암제로 널리 사용되고 있는 기존항암제인 시스플라틴 (CDDP)과 생약 AS193의 병용투여로 상승효과가 있는지를 관찰하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 즉, Nude mice (Balb/c, 6 week)를 각군 당 10마리 내외로 하여 총 4군 (총 40마리)으로 나누어 실험하였다. (Control군, AS 193 단독투여군, CDDP 단독투여군, AS193＋CDDP 병용투여군). AS193 투여군의 mice에는 100 ㎎/㎏로 일주일에 3회씩 12일간 경구 투여한 후, 모든 nude mice에 SKOV-3 cell을 5 × $10^6$ cells/0.2 ml RPMI/mouse로 쥐의 옆구리에 피하주사 하였다. Control 군 mice 종양의 크기가 100 ㎣가 되었을 때, CDDP를 1주일에 1회, 2 ㎎/㎏, i.v 하였으며, 총 3회 투여하였다. 이때 AS193은 일주일에 3회씩 계속 경구투여하면서 각 군의 mice의 생존기간과 종양의 크기를 측정하였다.그 결과, Control과 비교했을 매 AS193 단독투여 군, CDDP 단독투여 군, AS193＋CDDP 병용투여군 모두에서 종양성장 억제효과가 관찰되었다. 즉, CDDP 단독투여군, 15.8％, AS193 단독투여군, 27.8％, CDDP＋AS193 병용투여군, 44.2％의 억제효과를 나타내었으며, 특히, 그 중 CDDP＋AS193 병용투여 군이 가장 종양성장억제효과가 뛰어난 것으로 관찰되었다. 이로써 사람의 난소암 세포 주인 SKOV-3로 nude mice에 종양을 유도한 in vivo 실험에서는 AS193 단독투여로도 종양성장 억제효과가 우수하며, 더하여, AS193과 CDDP를 병용투여 했을 때에는 더욱 우수한 종양청장억제효과가 있음을 밝혔다. 수명연장효과는 AS193 단독 투여군에서 31.0％, CDDP＋AS193 병용투여군에서 6.7％의 연장효과를 나타내었다.

Abstract ▼

1. Purpose
1) Searchin for lead compounds to develope new drug having an antiviral activity from natural products
2) Searching for lead compounds to develope new drug having an antitumor activity from natural products using by in vitro and in vivo assay system
i) Screening the active compou

1. Purpose
1) Searchin for lead compounds to develope new drug having an antiviral activity from natural products
2) Searching for lead compounds to develope new drug having an antitumor activity from natural products using by in vitro and in vivo assay system
i) Screening the active compounds for gynecological cancer by using human uterus cancer cell lines, SK-OV-3, NIH-OV-CAR-3, cervical cancer cell lines, SiHa, HeLa, Breast cancer cell lin, MCF -7 in vitro
ii) Confirming the active compounds for gynecological cancer by using human cancer cell line, SK-OV-3, and nude mouse in vivo
3) Developing new combination therapy with anticancer drug currently used in clinical field.
4) Establishment of the in vitro and in vivo assay systems for cancer research, and built the infra for other cancer research
5) Enhencing the therapeutic efficacy for the patients of uterine cancer
2. Methods and Results
1) Purifiation and Structure determination of antiviral and cytotoxic agents
a) As a results of screening the active antiviral and/or cytotoxic activities from the methanol extracts of 202 natural products, AS7 showed prominent activities.
From AS7, Compound A (80 ㎎) was isolated as a cytotoxic agent using repeated silicagel column chromatography. Compound A was identified as a kind of mineral oil. The cytotoxicity was confirmed by LDH assay with SKOV-3 cell. ($IC_{50}$=3.52 ㎍/ml)
b) Mmagnolol, honokiol and fractions from Magnoliaceae plants showed cytotoxicity against SK-OV-3, SiHa, HeLa cell lines
c) Ginsenoside Rg3 and RKGI5, active fraction from AS193 showed strong cytotoxicity by LDH assay and MTT assay ($IC_{50}$=6.63, 4.29 and 2.43, 2.59 ㎍/㎖)
2) Inducing effect of apoptosis by purified fractions or compounds
a) The methanol extract of AS-7 showed apoptosis inducing activity (27.3％) by FACScan using Propodium Iodide and Annexine V double staining
b) Compound A did not show apoptosis inducing effect
c) Magnolol, honokiol and fraction, YK-et from Magnoliaceae also showed apoptosis inducing activity
d) Ginsenoside Rg3 did not showed apoptosis inducing effect, whereas RKG15 showed strong inducing activity of early stage of apoptosis (10.29％, two times of control). In addition, RKG15-1 and -2, more purified fractions of RKG15, RKG15-2 showed stronger (19.57％, 3.5 times of control) than RKG15-1 (11.87％,two times of control)
3) Aapoptosis inducing effect of taxol and its mechanism study
a) Staining with Annxin V and PI
Taxol showed primary apoptosis (or early apoptosis) and secondary apoptosis (late apoptosis or necrotic cell death) at the concentration of 5 μM after incubation of 18 and 24h.
b) DNA fragmentation rate and cell cycle assay
Sub-G1 phase was increased to 2 folds (11.33±1.91), when compared with control (5.25±1.23, mean ± SE, P < 0.05) Most of cells were arrested G2-M phage after taxol treatment for 24h.
c) Mitochondrial membrane potential assay (Green color Emission Shifting) using JC-1, lipophilic cationic fluorescence dye
Relative intensity at 530 nm wavelengths was increased 1.6 times in taxol treated cells after 24 h incubation.
d) ROS generation
ROS generation was not observed. There was no remarkable difference between taxol treated (3.11, 0.31) and normal cells (3.22±0.39)
e) Western blotting about BcI-2 and caspase-3
Taxol was treated as time dependent manner. Taxol induced BcI-2 phosphorylation, at a concentration of 2 mM and 5 mM of taxol treatment by western blot analysis. But caspase- 3, which has been shown to playa crucial role in apoptosis, was not activated. It means that taxol has independent mechanism from caspase pathway.
f) Determine to AIF (Apoptosis inducing factor) localization after taxol treatment by confocal microscope
Taxol treated cells are shown that AIF are localized cytosol and nuclear for 24h.
4) Combination therapy of AS193 and cisplatin (CDDP)
It was performed to evaluate the anti-tumor effect of AS193 and the effect of combination therapy with cisplatin (CDDP) on the tumor induced by SK-OV-3 ovarian cancer cell line to nude mice. Six weeks old nude mice were divided 4 groups, 10 mice of each group, control, CDDP treated, AS193 treated, and AS193-CDDP co-treated groups. For the mice of control and CDDP treated groups were fed saline through out the experimental period. For the mice of AS193 only and AS193-CDDP co-treated groups were fed AS193 at the dose of 100 ㎎/㎏/day, p.o. After medication of AS193 for 12 days, tumor cells, 5 × $10^6$ cells/mouse, were inoculated by s.c. on the flank of mouse. When the tumor size reached at 100 ㎣, CDDP was treated at the dose of 2 ㎎/㎏, i.v. for the mice of CDDP only and AS193-CDDP treated groups, once a week for three weeks. The tumor sizes were measured twice a week. The tumor growth was inhibited in all groups, CDDP-, AS193-, CDDP-AS193 co-treated groups, when compared with control group, 15.8％, 27.8％ and 44.2％, respectively, at 42 days after tumor inoculation. The survival rate were prominently increased in the mice of AS193 and AS193-CDDP treated groups, 31.0％ and 6.7％, respectively.

목차 Contents

• Ⅱ. 총괄연구개발과제 연구결과...9
• 1. 총괄연구개발과제의 최종연구개발목표...9
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...12
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...34
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...35
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획...37
• 6. 첨부서류...38
• 7. 참고문헌...43