초록 ▼

Alpha-synuclein은 대표적 노화 관련 퇴행성 신경질환인 노인성 치매 및 파킨슨씨병과 밀접한 관계를 맺고 있는 단백질로서 특히, 이 단백질에 의한 침착현상은 신경세포 사멸에 중요한 역할을 담당할 것으로 여겨지고 있음. 이에 본 연구과제의 최종목표로 α-synuclein 상호 작용성 물질을 동정하고 그 구조적 특징과 단백질 상호작용 과정의 생화학적 특성을 분석함으로써 α-synuclein 관련 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료책 개발을 궁극적 목적으로 설정하였음 본 최종목표에 이르는 접근방법으로는 상호 작용성 화합물을 α-sy

Alpha-synuclein은 대표적 노화 관련 퇴행성 신경질환인 노인성 치매 및 파킨슨씨병과 밀접한 관계를 맺고 있는 단백질로서 특히, 이 단백질에 의한 침착현상은 신경세포 사멸에 중요한 역할을 담당할 것으로 여겨지고 있음. 이에 본 연구과제의 최종목표로 α-synuclein 상호 작용성 물질을 동정하고 그 구조적 특징과 단백질 상호작용 과정의 생화학적 특성을 분석함으로써 α-synuclein 관련 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료책 개발을 궁극적 목적으로 설정하였음 본 최종목표에 이르는 접근방법으로는 상호 작용성 화합물을 α-synuclein 자가 중합체 유도 여부로 동정하고 선정하여, 신의약품개발의 lead compound를 제시하고자 하였음. 이는 동시에 chemical genetics로의 접근 가능성을 타진하게 할 것이며, 이를 이용하여 synuclein의 생리적 기능 이해와 병리적 효과의 조절과정에 활용할 수 있을 것으로 판단되었음. 생리적 기능 이해에 접근하는 다른 방법으로는 synuclein 상호 작용성 단백질(natural partner)을 분리하여 그들의 기능을 종합함으로써 synuclein의 병리효과를 단백질의 생리적 기능의 저하의 측면에서 이해하고 그에 따른 치료 및 예방책 개발을 제시하고자 하였음.
여러 후보물질의 α-synuclein 상호작용 여부는 chemical coupling reagent인 EEDQ나 DCCD를 이용하여 alpha-synuclein 중합체 유도에 기인하는 10-20% Tricine/SDS-PAGE상의 ladder의 형성으로 확인하였음. 그 중 선정된 두 가지 화합물로는 Phthalocyanine계 화합물과 Dequalinium이며 이들 화합물 및 그 유도체와 α-synuclein 상호작용이 집중적으로 연구되었음. Tetrapyrrole compound로서 Phthalocyanine (Pc) 계열 화합물은 anti-prion 활성을 나타냄으로써 퇴행성 신경 질환인 tranmissible spongiform encephalopathies (TSE)에 효과적인 것으로 보고되는 물질이다. Phthalocyanine (Pc)과 여기에 4개의 sulfonic group이 결합된 phthalocyanine tetrasulfonic acid (PcTS), 그리고 chelation된 금속이온[Cu2', Fe2'r, Zn2', Mnf', Ni2', Fe3', Al3']에 따른 유도체들을 이용하여 α-synuclein 상호작용을 면밀히 분석하몄음. 50 μM 농도에서 확인한 결과, PcTS-Cur'만이 유일하게 단백질의 자가 중합체를 유도하였음. Pc-Cua'와 비교할 경우, Pc에 치환된 sulfate group과 구리이온의 chelation이 synuclein 자가 중합체 유도에 매우 중요한 역할을 담당하고 있음 알 수 있음. Tetrapyrrole에 철이 들어있는 경우는 sulfate 치환에 상관없이 상대적으로 높은 농도(0.5 mM)에서 synuclein의 중합체를 유도하였음. 화학적 특이성이 높은 PcTS-Cua'의 synuclein 중합체 유도는 단백질의 산성 C-말단과는 독립적이며 N-말단에 의존적 현상임 을 여러 synuclein isoform (β-synuclein, α-synl-97, α-syn61-140, α-synuclein(AS3T), α-synuclein(A30P))를 이용하여 확인하였음.
반면, 구리가 결합되지 않은 PcTS의 경우는 C-말단 의존적 단백질 상호작용을 나타내고 있음을 단백질 응집동력학에 미치는 효과와 구리, 구리/과산화수소, eosin, PcTS-Cua', Aβ25-35등에 의한 α-synuclein 자가 중합체 형성에 미치는 경쟁적 효과를 분석함으로써 유추하였음. 이들과 단백질간 친화도를 분석할 경우, PcTS-Cua'(0.83 μM)가 PcTS(3.12 μM) 보다 약 4배가량 높은 synuclein 친화도를 나타내었으며 신약후보물질로의 잠재력을 지니고 있다고 판단됨. 단백질 응집과정에 미치는 효과를 분석하?는 단백질 응집의 lag phase 뿐만 아니라 final turbidity 역시 억제시킴을 확인하였음. 그러나 이렇게 형성된 최종산물들은 모두 섬유상구조물을 형성시켰음. 이들 응집물이 세포생존에 미치는 효과를 도파민생성세포(SH-SY5Y)를 이용하여 확인한 결과, PcTS에 의해 유도된 응집물의 경우는 α-synuclein 자체 응집물에 의한 세포독성보다 30% 가량 세포독성을 억제시키고 있음을 확인할 수 있었음 현재, 본 연구의 마지막 실험으로 세포내 과발현된 synuclein에 미치는 상기 화합물의 효과를 세포수준에서 확인되고 있음. 결과를 종합할 경우, PcTS 및 그 유도체들은 α-synuclein 관련 퇴행성 신경질환의 효과적 예방 및 치료제로서 그리고 나아가 단백질의 생리적 기능을 파악하는 과정에 이르기까지 유용하게 활용될 것으로 기대됨.
선정된 두 번째 화합물로 dequalinium은 두 개의 quinaldinium ring이 열 개의 탄소로 구성된 hydrocarbon으로 연결된 일종의 양쪽성양이온물질임. 이 물질은 항세균성물질로 알려져 왔으며 특히, ATP 합성효소 (FoFl-ATPase)와 Protein kinase C등의 활성을 선택적으로 억제시킴으로써 항암효과까지도 있는 것으로 보고되었음. 본 연구에서는 두 quinaldinium ring 사이의 hydrocarbon의 탄소수를 4, 6, 8, 10, 14로 증가시킨 유도체를 확보함으로써 그들과 α-synuclein 상호작용을 자가중합체 형성여부로 확인하였음. 결과, 두 개의 quinaldiniun ring이 탄수사슬로 연결된 경우에만 중합체 유도가 확인되었으며 탄소사슬의 길이가 길어질수록 중합체 유도가 잘 일어남. Dequalinium에 의한 자가중합체 유도는 단백질의 C-말단에 의존적이라는 사실을 synuclein isoform을 이용하여 확인하였음. 이는 PcTS-Cur'에 의한 중합체 형성 기작과는 정반대되는 결과임. 즉, PcTS-Cu2'와 dequalinium은 α-synulcein의 중합체를 공통으로 유도하지만 실질적 단백질 상호작용 기작은 서로 상이한 것으로 평가됨. Dequalinium과 α-synuclein간 Ke값 1.72 μM로 높은 친화도를 나타내었음. Dequalinium은 synuclein 응집을 촉진시켰으며 아밀로이드 생성을 유도하였음. 마지막 단계로 현재 이 물질이 세포내 과 발현된 α-synuclein에 미치는 효과를 분석하고 있음.
이와 함께, α-synuclein과 calmodulin 상호작용에 대한 연구가 부분적으로 진행되었으며 단백질의 세포내 calcium signaling 연관성이 제기되었음 따라서, 본 보고서에서 제시하는 α-synuclein 상호작용성 물질에 대한 연구는 궁극적으로 synuclein 관련 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료책 개발에 지대한 공헌을 할 것으로 기대됨. 또한, 나아가 단백질 응집현상과 단백질 침착관련 질병(암, 관절염, 당뇨병 등)의 중요한 기초 자료을 제공함으로써 순수학문과 인류 복지증진에 초석을 마련하게 될 것으로 기대됨.

Abstract ▼

Alpha-synuclein has been implicated in various neurodegenerative disorders such as Parkinson′s and Alzheimer′s diseases by participating abnormal protein aggregations. The ultimate goal of this project has been to develop therapeutic and preventive strategies toward the α-synucleinopathies by screen

Alpha-synuclein has been implicated in various neurodegenerative disorders such as Parkinson′s and Alzheimer′s diseases by participating abnormal protein aggregations. The ultimate goal of this project has been to develop therapeutic and preventive strategies toward the α-synucleinopathies by screening for α-synuclein interactive small molecules and characterizing their molecular interactions. Specifically, the molecules were pursued by examining whether they induced the protein self-oligormerization of α-synuclein in the presence of chemical coupling reagent of EEDQ or DCCD. The interactive molecules could be considered as lead compounds for eventual drug development, and used for "chemical genetic approach" to understand physiological functions of α-synuclein, which might provide tools to control the pathological effect of the protein. In addition, analyses of natural partners of the protein have been proposed to understand the physiological functions, which also holds for therapeutic potential by recognizing the pathological effect of α-synuclein in terms of its suppressed physiological functions.
Trial-and-errors made us select two types of chemicals - Phthalocyanine and Dequalinium - Phthalocyanine (Pc) compounds have been known to exhibit anti-prion effect, which could be applied for tranmissible spongiform encephalopathies (TSE). α-Synuclein interactions were investigated with various Pc congeners such as phthalecyanine tetrasulfonic acid (PcTS) and metal intercalates [Cu2', Fe2'r, Zna', Mna', Ni2'r, Fe3', Al3']. At a lower concentration of 50 μM, PcTS-Cu2' was the only chemical which induced the protein self-oligomerization. By comparing Pc effect on the protein, the sulfate substitution and copper intercalation turned out to be critical for the induction of protein self-oligomers. At a higher concentration (0.5 mM), iron-containging Pc compounds also caused the self-oligomerization. The biochemically specific PcTS-Cu2'interaction with a-synuclein appeared to be dependent upon the N-terminal region, independent of the acidic C-terminus, based on the observations with various synuclein isoforms, such as β-synuclein, α-synl-97, α-syn61-140, α-synuclein(A53T), α-synuclein(A30P).
On the other hand, the Cu2' lacking PcTS interacted with α-synuclein mainly around the C-terminal region, which was concluded by investigating the chemical effects on the protein aggregation kinetics and tile Competitive effects of PcTS during the protein self-oligomerizations induced by copper, eosin, PcTS-Cua', Aβ25-35, and copper/H₂O₂. By comparing dissociation constants, PcTS-Cua'(0.83 μM) showed 4 times higher affinity for the protein than PcTS (3.12 μM), which might indicate they both have a potential for possible drug candidates. The two chemicals exhibited the opposite effects on the protein aggregation of α-synuclein. While PcTS-Cua' stimulated the aggregate formation, PcTS exhibited the anti-aggregative effect by reducing the lag phase as well as the final turbidity. All the final aggregates appeared filamentous under electron microscope. Cytotoxicity of the PcTS-induced aggregates was 30% less than the aggregates formed by α-synuclein alone. As a final step, the chemical effect en the transiently overexpressed α-synuclein in SH-SY5Y cells has been investigated.
The second compound was dequalinium (DQ) which has two quinaldinium rings separated by a hydrocarbon chain with 10 carbons. It has been known to have both antibiotic and antitumor effects by inhibiting FoFl-ATPase and Protein kinase C, respectively. We have collected DQ analogs with different chain length of the hydrocarbon (carbon number = 4, 6, 8, 10, 14). To induce the self-oligomerization of α-synuclein, the two quinaldinium rings must be connected by a hydrocarbon chain. The longer the chain becomes, the more effective, self-oligomerization was resulted in. This interaction was dependent upon the acidic C-terminus of a-synuclein, which was distinct from the PcTS-Cu2'interaction. This fact indicates that beth chemicals gave rise to the common phenomenon of protein self-oligomerization despite of their distinctive interactions with α-synuclein. Dissociation constant between dequalinium and α-synuclein was Kd 1.72 μM. The compound stimulated the amyloid formation of α-synuclein. Now, its effect on the overexpressed protein has been examined within SH-SY5Y cells. In addition, calmodulin interaction of α-synuclein has been partly examined, which might indicate tile protein could be involved in calcium signaling process.
Taken together, the compounds introdued in this study might have promise for eventual development of therapeutic and preventive drugs, and contribute to unveil physiological functions of α-synuclein. In addition, they could be used for other degenerative disorders, such as cancer, diabetes, and rheumatoid arthritis, which involve abnormal protein depositions.

목차 Contents

• Ⅱ. 총괄연구개발과제 연구결과...8
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...8
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...13
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...29
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...31
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획...32
• 6. 첨부서류...33
• Ⅲ. 제 1세부연구개발과제 연구결과...34
• 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...35
• 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...39
• 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...41
• 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...55
• 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...57
• 6. 제1세부연구개발과제의 활용계획...58
• 7. 참고문헌...58