초록 ▼

1) 연구 목적:
본 연구의 목적은 조혈모세포 이식시 MSCs를 동시에 이식함으로서 조기 골수기능 회복을 유도하여 감염에 의한 사망률을 줄이며 면역 관용을 유도하며 GVHD를 억제할 수 있는 새로운 조혈모세포 이식술을 개발함에 있다. 본 연구를 성공적으로 완수하기 위하여 제 1 세부과제에서는 주고 MSCs의 동시이식을 이용하여 조혈모세포의 골수내 생착 촉진과 생착 된 조혈모세포가 각종 조혈전구세포로 성공적으로 분화하는지를 연구하고, 제 2 세부과제에서는 MSCs의 면역학적 기능을 연구하고 조혈전구세포와 동시 이식시 면역관용을

1) 연구 목적:
본 연구의 목적은 조혈모세포 이식시 MSCs를 동시에 이식함으로서 조기 골수기능 회복을 유도하여 감염에 의한 사망률을 줄이며 면역 관용을 유도하며 GVHD를 억제할 수 있는 새로운 조혈모세포 이식술을 개발함에 있다. 본 연구를 성공적으로 완수하기 위하여 제 1 세부과제에서는 주고 MSCs의 동시이식을 이용하여 조혈모세포의 골수내 생착 촉진과 생착 된 조혈모세포가 각종 조혈전구세포로 성공적으로 분화하는지를 연구하고, 제 2 세부과제에서는 MSCs의 면역학적 기능을 연구하고 조혈전구세포와 동시 이식시 면역관용을 일으켜 GVHD를 효과적으로 억제할 수 있는가를 연구한다.
2) 연구 방법 :
- 제 1 세부과제 -
(1) Xeno-transplantation model을 확립하기 위하여 NOD/SCID mice에게 sublethal dose(350cGy)의 방사선을 조사한 후 사람 제대혈 CD34 양성세포 $1-2{\times}10^5$/mouse를 이식하여 생착 여부를 확인.
(2) 배양된 MSCs에 GFP 유전자를 도입하여 지속적으로 GFP유전자를 표현하는 MSCs를 생산 (MSC-GFP).
(3) sub-lethal dose의 방사선 치료를 받은 NOD/SCID mice에 MSC-GFP 세포를 이식하여 이식 1개월과 3개월에 골수내에서의 MSCs의 존재를 확인하고, 흉선, 간, 비장, 등의 각종 장기에서 분화된 MSCs의 존재 확인.
(4) 배양된 MSCs와 사람 cord blood CD34 양성 세포를 동시에 이식한 mice와 CD34 양성세포만을 이식한 쥐에서 이식 1개월 후에 골수내의 CD34와 CD45 양성세포의 생착율을 비교.
(5) 배양된 MSCs와 사람 cord blood CD34 양성 세포를 동시에 이식한 mice와 CD34 양성세포만을 이식한 쥐에서 이식 1개월후에 골수내의 CD45 양성세포 중 CD3, CD4, CD14, 및 CD19의 생착율을 비교하여 이식 된 조혈모세포가 성공적으로 분화되는지를 CD34 양성세포만을 이식받은 쥐에서와 비교.
- 제 2 세부과제 -
(1) MSC의 면역학적 특성을 연구하여 MSC의 면역 기능을 확인.
(2) MSC의 표면항원을 확인하여 배양 과정중의 변화를 확인함으로서 동종골수 이식이전의 면역학적 특성을 검증
(3) 역류 원심성 세포분리를 통하여 공여 마우스 골수에서의 T 세포 분리정도를 확인하여 세포분리법에 대한 정도 관리를 확인.
(4) MHC가 불일치하는 마우스 동종골수이식을 시행하여 GVHD 모델의 정도 관리 및 GVHD 양성 대조군의 결과를 확인.
(5) MHC가 불일치하는 마우스 동종골수이식시 MSC를 동시 및 추가 이식하여 GVHD의 변화양상을 확인.
(6) MHC가 불일치하는 마우스 동종골수이식시 T 세포를 제거하여 골수를 이식하면서 녹색형광 단백질을 함유한 MSC를 동시 및 추가 이식하여 장기 생존을 확인하며 MSC의 분포를 알아본다.
3) 연구 결과 :
- 제 1 세부과제 -
(1) 성인 골수로부터 채취하여 배양한 중간염 줄기세포는 지방세포, 골세포, 연골세포 등의 중간엽 세포로 분화 유도되었다.
(2) 이종 조혈모세포이식시 인간 CD45 양성세포와 CD45 양성-CD34 양성세포의 생착률은 CD34 양성세포와 중간엽 줄기세포를 동시에 이식받은 경우가 CD34 양성세포만을 이식받은 경우에 비하여 의미있게 높았다.
(3) 마우스의 골수내에서 골수계로 분화한 세포의 수는 중간엽 줄기세포를 동시에 이식한 경웨 의미있게 많았으나 림프계로 분화한 세포의 수는 차이가 없었다.
(4) 이종 조혈모세포 이식시 MSCs를 $1 {\times} 10^6$ 투여한 군과 $5 {\times} 10^6$을 투여한 군의 조혈모세포 생착율을 비교하였을 때 $5 {\times} 106$ 투여한 군에서 조혈모세포 및 골수계 및 B 림프계로 분화한 세포의 생착율이 증가하였다.
(5) MSCs 동시 이식 후 쥐의 각?며, MSCs를 $1 {\times}10^6$을 투여한 군에서 더 많은 장기에서의 분포를 확인하였으며 장기내의 MSCs의 분포도 증가하는 것이 확인되었다.
- 제 2 세부과제 -
(1) 혼합림프구 반응에서 MSC를 첨가한 군에서는 대조군에 비하여 약 65％의 림프구증식억제효과를 확인하였으며 CSA(70％)와 FK506(75％)와 큰 차이없이 증식억제효과를 알 수 있었다.
(2) IL-2를 혼합림프구배양 과정중에 첨가한 길과 IL-2를 첨가한 경우에는 억제 효과는 약 15％정도로 나타나 IL-2가 MSC의 면역억제효과를 감소시키는 것을 확인하였다.
(3) 동종조혈모세포이식후 대조군은 이식 4-8일에 현저한 체중감소를 보이면서 심각한 GVHD를 나타냈고 이식 35일까지의 생존은 16.7％이었다. 반면에, MSC이식군은 이식 초기에 체중감소가 없었으며 경도의 GVHD를 나타내면서 이식 35일에 66.7％의 생존을 확인하였다. 이식 35일에 시행한 키메리즘에서 비장세포에서 44.3％, 골수에서 14.3 0.5％, 흉선에서 40.3 4.2％dml H-2K 양성세포를 확인하였고 특정 장기나 골수에서 이상조직(abnormal tissue)등이 없었으며 골수의 세포충실도는 80％이었다.
(4) MSC와 골수를 이식한 마우스에서 이식 35일에 골수, 비장, 흉선을 제거하여 공여 마우스의 세포의 분포를 유세포분석을 통하여 확인하였다. 골수보다 비장이나 흉선에서 공여마우스의 세포가 현저하게 존재하는 키메리즘을 확인할 수 있었다.
4) 결론
본 연구에서는 인간의 MSCs를 체외에서 줄기세포의 성격을 유지한 상태로 증식시킬 수 있음을 증명하였으며 조혈모세포 이식시 MSC의 동시 이식이 이식 후 조혈모세포의 생착을 촉진시키고 이식편대 숙주반응을 예방할 수 있는 가능성이 높음이 발혀졌다. 특히 MSCs의 양이 조혈모세포이 생착을 증가시킬 수 있다는 결과는 아직 다른 연구자들에 의하여 발표된 바 없다. 본 연구는 타인간 조혈모세포 이식, 제대혈 이식, 고령자의 이식과 같이 기존의 표준 조혈모세포 이식으로는 위험도가 높은 경우에 효과적인 조혈모세포 이식을 수행할 수 있는 새로운 조혈모세포 이식 기법의 개발에 중요한 기초 자료로 활용될 수 있으며, 앞으로 본 연구를 바탕으로 환자를 대상으로 하는 MSCs 동시 이식의 임상시험도 시도해 보아야 할 것으로 생각된다.

Abstract ▼

1) The aim of this project
Mesenchymal stem cells (MSCs) have recently been identified and characterized in humans. MSCs are shown to secrete hematopoietic cytokines and support hematopoietic progenitors in vitro. We hypothesized that cotransplantation of MSCs could enhance engraft of human hemat

1) The aim of this project
Mesenchymal stem cells (MSCs) have recently been identified and characterized in humans. MSCs are shown to secrete hematopoietic cytokines and support hematopoietic progenitors in vitro. We hypothesized that cotransplantation of MSCs could enhance engraft of human hematopoietic stem cells and the effect on engraftment could increase according to the amount of infused MSCs. We also evaluated the immune tolerance induction after transplantation of MSCs and hematopoietic stem cells(HSCs).
2) Materials and Methods
Subject ,1
(1) Collection and isolation of CD34+ cells from umbilical cord blood (UC)
(2) Human MSC isolation and ex vivo culture
(3) Xenotransplantation of human cord blood CD34+ cells and MSCs into mice
(4) Detection of human hematopoietic cells in NOD/SCID mice by flow cytometry.
Subject 2
(1) Immunologic chatacterization of the MSCs.
(2) Evaluation of the surface antigen of the MSCs
(3) Establishment of the mouse GVHD model during stem cell transplantation
(4) Allogeneic mouse stem cell transplantation using co-transplantation of the MSCs and HSCs and evaluation of the GVHD incidence and survival of the mouse.
(5) Check the mixed chimerism after MSC co-transplantation in mouse
3) Results
Subject 1
(1) CD4S5+ and CD45+-CD34+ cells significantly increased in co-transplanted mice in a dose dependent fashion after 4 weeks.
(2) The engraftment of CD13+ and CD33+ myeloid cells also increased in a dose dependent fashion.
(3) The engraftment of CD19+ B lymphocytes only increased in cotransplantation of $5 {\times} 106MSCs$. The engraftment of CD3+ lymphocytes did not increased after cotranplantation of MSCs after 4 weeks.
(4) FISH did not demonstrated human cells in multiple tissues when transplanted with $1 {\times} 105$ CD34+ cells but human cells can be found in multiple tissues in cotransplanted mice and increased not only the type of tissues but also the number of cells in mice cotransplanted $5 {\times} 106$ MSCs.
Subject 2
(1) Irradiated mesenchymal stem cells (MSC) inhibit splenocyte proliferation, but non-irradiated MSC contribute cell proliferation. However, addition with IL-2 has compensated against inhibitory effect of MSC (P ＜ 0.05).
(2) Irradiated mesenchymal stem cells (MSC) inhibit lymphocyte proliferation, comparable to calcineurin hinibitors under IC50 (P ＜ 0.05_).
(3) The survival in mice with bone marrow and mesenchynal stem cell is longer than other experimental groups (P = 0.0057) until post-BMT 35 day. Transplantation with MSC may have survival benefit, even though mice received with MSC and splenocytes died within post-BMT 9 day.
(4) The scores of GVHD in mice received with bone marrow (BM) and C3H/10T1/2 cell line were lower than GVHD control and mice with BM.
(5) The engraftment of donor cells is higher in thymus and spleen than bone marrow after allogeneic transplantation in mouse
4) Conclusions
The results presented here suggest that MSCs are capable of enhancing hematopoietic engraftment and reducing GVHD after co-transplantation of MSCs and HSCs.

목차 Contents

• II. 총괄연구개발과제 연구결과...8
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...8
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...17
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...35
• 4. 사업화 목표 달성도 및 계획(개발과제만 해당)...40
• 5. 총괄연구개발과제의 연구성과...41
• 6. 연구개발결과의 파급효과...59
• 7. 첨부서류...61
• III. 제 1 세부연구개발과제 연구결과...125
• 1. 제 1 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...126
• 2. 제 1 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...132
• 3. 제 1 세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...135
• 4. 제 1 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...139
• 5. 제 1 세부연구개발과제의 연구성과...141
• 6. 참고문헌...149
• IV. 제 2 세부연구개발과제 연구결과...153
• 1. 제 2 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...154
• 2. 제 2 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...161
• 3. 제 2 세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...164
• 4. 제 2 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...173
• 5. 제 2 세부연구개발과제의 연구성과...176
• 6. 참고문헌...183