초록 ▼

Growth hormone과 같은 protein 호르몬등은 경구 투여할 경우 소화기관을 통과하면서 장내에서 분비되는 각종 protease에 의해 분해되거나, 낮은 pH에서 변성에 의해 기능을 상실하거나, 온전하게 흡수장소까지 도달한다 할지라도, 소장의 enterocyte에 의해 효율적으로 흡수이용되지 못하기 때문에, 경구투여를 하지 못하고 주사 투여를 해야하는 등의 많은 어려운 문제점이 있다. 따라서 본 연구에서는 이러한 문제점을 해결하기 위하여 경구투여용 growth hormone 분비 유산균제제의 개발 즉, 각종 hormone

Growth hormone과 같은 protein 호르몬등은 경구 투여할 경우 소화기관을 통과하면서 장내에서 분비되는 각종 protease에 의해 분해되거나, 낮은 pH에서 변성에 의해 기능을 상실하거나, 온전하게 흡수장소까지 도달한다 할지라도, 소장의 enterocyte에 의해 효율적으로 흡수이용되지 못하기 때문에, 경구투여를 하지 못하고 주사 투여를 해야하는 등의 많은 어려운 문제점이 있다. 따라서 본 연구에서는 이러한 문제점을 해결하기 위하여 경구투여용 growth hormone 분비 유산균제제의 개발 즉, 각종 hormone 등의 경구투여를 위한 delivery system 개발을 위한 model로써 human growth hormone 유전자와 유산균 vector, 유산균 및 장상피세포에서의 transcytosis를 위한 functional moiety(lactoferrin과 transferrin의 C-lobe, 그리고 human IgG의 $CH_2$와 $CH_3$ domain)를 이용하여 경구투여용 growth hormone 분비 미생물제제를 개발하고자 하였다.
이를 위하여 본 연구에서는 1) 장상피세포에서의 transcytosis효율을 검증하기 위하여 T84 cell line을 이용 in vitro transcell culture상에서의 transcytosis assay 방법을 개발하였고 (제 1 세부과제) 2) 장상피세포에서 transcytosis를 유도할 수 있는 후보 단백질군을 제작하기위해서 장상피세포에서 transcytosis를 유도할 수 있는 후도단백질군으로 알려진 lactoferrin과 transferrin의 C-lobe, 그리고 human IgG의 $CH_2$와 $CH_3$ domain을 이용하여 human growth hormone 유전자와 fusion proteins를 제작하였으며(제 1 세부과제) 3) 이들 fusion proteins을 이용 Pichia pastoris expression system에서 발현 및 정제 후 transcytosis 활성을 확인하였다(제 1세부과제). 이렇게 발굴된 후보단백질군을 장내로 무사히 전달하기위한 시스템인 유산균에서 발현시키기위해 4) 유산균에서의 최대 발현을 위한 유산균 발현 vector system을 개발하기 위하여 유산균의 genomic DNA에 삽입되지 않고 episomal 상태에서 제 1세부과제에서 제작된 fusion protein을 발현시킬 수 있는 episomal vector와 유산균의 genomic DNA 에 원하는 유전자가 integration되어 발현시킬 수 있는 integration vector를 구축하여 제 1세부과제에 제공하였으며(제 2세부과제) 5) 규명된 최고의 활성을 가진 후보 protein을 Lactobacillus 속의 미생물에서 발현 정제 시킨후 transcytosis activity 측정하였다. 한편 당초 계획상의 재조합 유산균의 정상피세포와의 adhesion 능력을 in vitro cell culture 상에서 확인하는 실험을 대체하여 보다 직접적인 결과를 제시하기 위해 실험용 흰쥐를 이용한 in vivo 경구투여 실험을 통해 본 실험을 통하여 개발한 경구투여용 human growth hormone을 분비하는 유산균제제의 효과를 규명하였다(제1세부과제).

Abstract ▼

It has been understood that the MHC class-I related IgG receptor has mutiple functions such as the passive delivery of immunoglobulin (Ig)Gs from mother to young and the regulation of serum IgG levels. In addition, FcRn expression in tissues such as liver, mammary gland, and adult intestine suggests

It has been understood that the MHC class-I related IgG receptor has mutiple functions such as the passive delivery of immunoglobulin (Ig)Gs from mother to young and the regulation of serum IgG levels. In addition, FcRn expression in tissues such as liver, mammary gland, and adult intestine suggests that it may modulate IgG transport at these sites. These diverse functions are apparently brought about by the ability of FcRn to bind IgGs and transport them within and across cells. (3) Futhermore, it is well understood that the Fc amino acids are highly conserved in rodents and man and interact with residues primarily located on the alpha2 domain of FcRn and rodent FcRn has affinity to human IgG.(3,4)
As information about the MHC class-I related IgG receptor is revealed more and more, people have interested in developing the Fc fragment of IgG-based therapeutics and modulating the IgG serum half-life. (6,7)
Therefore we produced the lactobacillus producing a fusion protein, consisting of the mature part of hGH and Fc fragment of human IgG1 fused to the secretional signal of the S-layer protein of Lactobacillus. brevis. Because Lactobacillus has capability to colonize on the mammalian intestine and to secret the human GH coupled human Fc, the lactobacillus producing the fusion protein could deliver the human GH coupled Fc across intesinal barrier to the blood stream. Futhermore, Fc fragment of the protein could prolong the life time of the human GH coupled Fc.The secretional protein was analysed by western-blotting, ELISA and bioassay.
We showed that Lb.brevis can efficiently secrete biological active candidate fusion protein and that the candidate protein have two functional activities of hGH and transcytosis using transwell system and in vivo test in Sprague. Dawley. rat.
Our results showed that the hGH-Fc protein could be transported through the epithelial barrier both in T84 cell line monolayer transwell system and suckling-to-after weaning young rodents although the level of the transcytosis in after weaning. The growth hormone activity was represented both in suckling rodents and after weaning in young rodents. Additionally, it was revealed that the Lactobacillus could be very efficient carrier for the Fc fusion proteins. This is why Lactobacillus could colonize in the gastro tract and produce the protein appropriately. Furthermore, Lactobacillus could give the advantages to host as probiotics.

목차 Contents

• Ⅱ. 총괄연구개발과제 연구결과...8
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...8
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...14
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...51
• 4. 사업화 목표 달성도 및 계획(해당사항 없음)...52
• 5. 총괄연구개발과제의 연구성과...53
• Ⅲ. 제 1 세부연구개발과제 연구결과...59
• 1. 제 1 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...60
• 2. 제 1 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...64
• 3. 제 1 세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...70
• 4. 제 1 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...95
• 5. 제 1 세부연구개발과제의 연구성과...96
• 6. 참고문헌...99
• Ⅲ. 제 2 세부연구개발과제 연구결과...109
• 1. 제 2 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...110
• 2. 제 2 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...113
• 3. 제 2 세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...119
• 4. 제 2 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...134
• 5. 제 2 세부연구개발과제의 연구성과...135
• 6. 참고문헌...137