초록 ▼

◇ 연구개발 사업의 목적
(1) Doxorubicin에 의한 mitotic cell death의 특징에 대한 세포샘물학적, 생화학적 분석
(2) 효과적인 항암 치료책으로써 mitotic cell death 유도의 효용성 분석
◇ 연구 방법
(1) Doxorubicin에 의한 mitotic cell death의 특징에 대한 세포생물학적, 생화학적 분석
1) 세포 내 소기관들의 구조 및 기능 변화
① 핵 (핵 염색, FACS 분석)
② mitochondria (MMP 변화 분석, cytochrome

◇ 연구개발 사업의 목적
(1) Doxorubicin에 의한 mitotic cell death의 특징에 대한 세포샘물학적, 생화학적 분석
(2) 효과적인 항암 치료책으로써 mitotic cell death 유도의 효용성 분석
◇ 연구 방법
(1) Doxorubicin에 의한 mitotic cell death의 특징에 대한 세포생물학적, 생화학적 분석
1) 세포 내 소기관들의 구조 및 기능 변화
① 핵 (핵 염색, FACS 분석)
② mitochondria (MMP 변화 분석, cytochrome c 방출 분석)
③ Iysosome (전자현미경 관찰, SA-β-galactosidase assay, cathepsin B 발현 변화 분석)
④ plasma membrane (Annexin V/PI 염색)
2) Caspases의 관여 여부 분석 (Caspase들의 proteolytic processing 분석, 특이 억제제 효과)
3) Non-caspase의 관여 여부 분석 (calpain, cathespsin 발현 변화 분석, 특이 억제제 효과)4) NF-kB의 관여 여부 분석 (IkB-α 발현 변화, 특이 억제제 효과)
(2) 효과적인 항암 치료책으로써 mitotic cell death 유도의 효용성 분석
1) Bcl-xL 과발현 세포에서의 mitotic cell death의 발생 정도 분석 (Live & Dead kit)
2) 저농도 doxorubicin의 단기간 투여 시 간암세포의 증식 능력의 복구 및 항암제 내성 획득 분석 (colony forming assay, Live & Dead kit)
3) 저농도 doxorubicin에 노출된 간암세포가 다른 암세포 성장에 미치는 paracrine effect (MTT assay)
◇ 연구결과
본 연구는 p53 mutant인 Huh-7 간암세포를 대상으로 하여 간암 치료에 흔히 쓰이고 있는 doxorubicin을 저농도로 투여함으로써 apoptosis와는 형태학적으로 전혀 다른 세포 사멸 mode인 mitotic cell death를 유도하는 model system을 구축하였다.
어떤 요인에 의해 apoptosis 또는 mitotic cell death로의 서로 다른 세포 사멸 운명이 결정되는지, 또한 이 두가지 세포 사멸 mode 유도에 관여하는 신호전달 경로는 어떻게 다른지 등에 대해서는 연구되어진 것이 거의 없다. 본 연구에서는 이 두 사멸 mode간의 생화학적 차이를 보다 잘 이해하기 위하여 다양한 각도에서 각 특성을 비교, 분석하였다. 저농도 doxorubicin에 의한 mitotic cell death 유도 시에는 mitochondria의 기능이 감소하고 cytochrome c가 세포질로 방출된다는 점, lipid bilayer에서 phosphatidyl serine이 externalization이 일어난다는 점 등에 있어서는 고농도 doxorubicin에 의한 apoptosis와 공통점이 있다. 그러나 다음과 같은 점에서 apoptosis와 뚜렷한 차이가 나므로, 저농도 doxorubicin에 의해 유도되는 mitotic cell death는 고농도 doxorubicin에 의해 유도되는 apoptisis와는 조절 기전이 전혀 다른 별개의 세포 사멸 mode라고 결론지을 수 있다.
① Apoptosis는 12시간 내에 발생하여 빠르게 진행되는데 반해, mitotic cell death는 6-15일이 걸리므로 세포 사멸 진행이 느리다.
② Apoptosis가 일어나는 세포들은 일반적으로 수축하나 mitotoci cell death가 발생하는 세포들은 다핵화되면서 세포가 커진다.
③ Apoptosis 시에는 보통 plasma membrane integrity가 유지되나 mitotic cell death가 발생하는 세포에서는 integrity를 잃는다.
④ Apoptosis가 일어나는 세포에서는 DNA contents가 보통 subdiploid이나 mitotic cell death가 일어나는 세포에서는 hyperploid (>4n)이고 heterogeneous하다.
⑤ Apoptosis 시에 활성화되는 JNK, p38, NF-κB같은 stress-activated signaling pathway들이 mitotic cel death 시에는 활성화되지 않는다.
⑥ Apoposis 시에 활성화되는 caspases가 mitotic cell death 유도 시에는 뚜렷이 활성화되지 않으므로 calpain이나 cathepsin 같은 protease들이 관여될 가능성이 있다.
또한, Bcl-xL이 과발현된 세포에서도 mitotic cell death가 잘 발생하며, Bcl-xL의 발현이 높지 않은 세포에 비해 저농도 doxorubicin에 노출된 후 암세포 증식 능력이 더 잘 복구된다거나 다른 항암제에 대한 내성이 더 증가하지는 않는 것으로 분석되었다. 간암세포에서는 50% 이상의 암세포에서 p53가 mutation되어 있고 Bcl-xL의 발현이 높아, 이로 인해 각종 항암제를 써도 항암효과가 좋지 않은 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구는 p53나 Bcl-xL의 이상 발현으로 인해 항암제에 의한 apoptosis에 resistant한 간암 세포의 경우, 저농도 doxorubicin을 이용한 mitotic cell death의 유도를 통해 항암 효과를 증진시킬 가능성이 있음을 최초로 제시하였다.

Abstract ▼

◇ Purpose of this research
(1) Biochemical characterization of doxorubicin-induced mitotic cell death
(2) Evaluation of the usefulness of doxorubicin-induced mitotic cell death for the effective cancer therapy
◇ Methods
(1) Biochemical characterization of doxorubicin-induced mitotic cell

◇ Purpose of this research
(1) Biochemical characterization of doxorubicin-induced mitotic cell death
(2) Evaluation of the usefulness of doxorubicin-induced mitotic cell death for the effective cancer therapy
◇ Methods
(1) Biochemical characterization of doxorubicin-induced mitotic cell death
1) Changes in the structure and function of the subcellular organelles
① Nuclei (Nuclear staining, FACS analysis)
② mitochondria (Changes in MMP, release of mitochondrial cytochrome c)
③ lysosome (Electron microscopy, SA-β-galactosidase assay, changes in cathepsin B expression)
④ plasma membrane (Annexin V/PI staining)
2) Involvement of caspases (Proteolytic processing patterns of caspases, effects of the specific inhibitors of caspases on mitotic cell death)
3) Involvement of non-caspase (changes in calpain and cathespsin expression, effects of their specific inhibitors on mitotic cell death)
4) Involvement of NF-kB (changes in IkB-α expression, effect of NF-kB inhibitor on mitotic cell death)
(2) Evaluation of the usefulness of doxorubicin-induced mitotic cell death for the effective cancer therapy
1) Occurrence of mitotic cell death in cells overexpressing Bcl-xL (Live & Dead kit)
2) Recovery of the replicative capacity of cancer cells after exposure to doxorubicin of low dose and their acquirement of resistance to anti-cancer agents (colony forming assay, Live & Dead kit)
3) Paracrine effect of cancer cells exposed to doxorubicin of low dose on the proliferation of other cancer cells (MTT assay)
It is not fully known how two different cell death fates, mitotic cell death and apoptosis, are determined in terms of factors or signaling pathways. In an attempt to better understand the biochemical differences between mitotic catastrophe and apoptosis, we compared various aspects of two modes of cell death induced by different doses of the same drug, doxorubicin in Huh-7 hepatom cell with mutant p53. Our molecular analysis showed that low dose doxorubicin-induced mitotic cell death shares some common characteristics with high dose doxorubicin-induced apoptotic cell death, such as the release of mitochondrial cytochrome c into the cytosol and extemalization of phosphatidyl serine in the plasma membrane. However, the following novel results suggest that low dose doxorubicin-induced mitotic catastrophe is a different death mode from high dose doxorubicin-induced apoptosis as follows:
① Mitotic catastrophe takes 6-15 days, while apoptosis can occur within 12 hours.
② Cells undergoing mitotic cell death become multinueleated and large, whereas apoptotic cells shrink.
③ Plasma membrane integrity is lost during mitotic catastrophe, but maintained during apoptosis.
④ The DNA contents in cells undergoing mitotic catastrophe are hyperploid and very heterogeneous, while cells undergoing apoptosis are mostly subdiploid.
⑤ Stress-activated signaling pathways such as JNK, p38, and NF-kB are significantly activated during apoptosis but not during mitotic catastrophe.
⑥ Caspases are not significantly activated during mitotic cell death and non-caspases such as calpain or cathepsins may be involved in mitotic cell death.
Doxorubicin-induced mitotic cell death was not significantly blocked by Bcl-xL overexpression. Furthennore, Bcl-xL overexpression did not increase the replicative capacity of cancer cells after exposure to doxorubicin of low dose and resistance to anti-cancer agents. Mutation of p53 gene (>50%) and overexpression of Bcl-xL are very frequently observed in hepatocellular carcinoma, suggesting that they may be responsible for resistance of hepatoma cells to various anti-cancer drugs. The fact that the regulatory mechanisms involved in HD doxorubicin-induced apoptosis differ from those mediating LD doxorubicin-induced mitotic cell death suggests that induction of mitotic cell death may be a valid strategy for killing cancer cells with inherently faulty apoptotic programs.

목차 Contents

• 표지 ...1
• 제출문 ...2
• 목차 ...3
• I. 연구개발결과 요약문 ...4
• 한글요약문 ...4
• SUMMARY ...6
• II. 총괄연구개발과제 연구결과...8
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...8
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...14
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...39
• 4. 사업화 목표 달성도 및 계획(해당사항 없슴)...40
• 5. 총괄연구개발과제의 연구성과...40
• 6. 연구개발결과의 파급효과...45
• 7. 첨부서류...46