초록 ▼

연구 목적
어떠한 화학 물질이 개발이 되었을 경우 특히 피부에 국소 도포하는 제제라면 피부에 대한 자극성 검사와 광독성 검사를 거쳐 안정성을 인정받아야 하는 것으로 되어 있다. 이러한 광독성에 대한 안정성 실험으로 직접 인체에 노출하는 것은 윤리적인 문제가 있어 힘들다고 할 수 있어서 in vivo를 대체할 수 있는 실험실적인 방법이 필요하다. 최근 진피대응물 위에서 각질형성세포를 3차원적으로 배양한 인공 피부 모델이 인체의 피부와 형태학적, 생화학적 성상이 비슷하며 자외선에 대한 반응 또한 유사한 것으로 알려져 인체의 피부를

연구 목적
어떠한 화학 물질이 개발이 되었을 경우 특히 피부에 국소 도포하는 제제라면 피부에 대한 자극성 검사와 광독성 검사를 거쳐 안정성을 인정받아야 하는 것으로 되어 있다. 이러한 광독성에 대한 안정성 실험으로 직접 인체에 노출하는 것은 윤리적인 문제가 있어 힘들다고 할 수 있어서 in vivo를 대체할 수 있는 실험실적인 방법이 필요하다. 최근 진피대응물 위에서 각질형성세포를 3차원적으로 배양한 인공 피부 모델이 인체의 피부와 형태학적, 생화학적 성상이 비슷하며 자외선에 대한 반응 또한 유사한 것으로 알려져 인체의 피부를 대체할 수 있는 유용한 실험실적인 방법으로 많은 연구가 되고 있다. 이에 본 연구자들은 각질형성세포만이 아니라 자외선에 대한 인체의 반응에서 매우 중요한 멜라닌 세포를 포함한 인공 피부 모델을 제조하고 실험실적인 광독성 시험의 기준이 되는 실험 방법으로서의 이 모델의 활용성에 대해서 알아보고자 하였다.
연구 방법
먼저 실험 물질로는 8-Methoxypsoralen, 6-methylcoumarin, tetracyclin을 사용하였고 각각의 물질의 광독성도를 유럽에서 실험실적인 광독성도 검사로 유효성을 입증 받아 표준화되어 있는 방법인 373 NRU PT (373 Netral red uptake phototoxicity test)를 시행하여 측정하였다. 자외선은 광독성을 주로 일으키는 것으로 알려진 UVA 파장의 빛을 방출하는 $UVASUN^{(R)}$를 이용하여 조사하였다. 멜라닌 세포가 포함된 인공 피부 모델을 제조차고 UVA 와 UVB를 조사한 후 광생물학적 반응을 관찰하였다. 또한 인공 피부 모델에 각각의 물질을 국소 도포한 후 UVA를 조사한 후 형태학적인 관찰과 함께 면역조직화학 검색을 통해 표피의 분화 양상에 대해 관찰하고 Fontanna- Masson 염색을 이용하여 멜라닌화를 관찰하였다. 시험 물질의 광독성도에 관해서는 염증성 cytokine 인 $IL-1\;{\alpha},\; IL-{\beta}, IL-6$ 를 이용하여 측정하였다.
결과
373 NRU PT에서 8-Hethoxypsoralen, 6-methylcdumarin, tetracyclin 의 순으로 시험 물질의 광독성도가 낮아지는 것을 관찰할 수 있었다. 인공 피부 모델에서의 자외선을 조사한 후에 광생물학적인 반응은 형태학적인 면이나 표피의 분화 상태, 멜라닌 화의 정도의 측면에서 인체의 피부와 매우 유사한 것을 관찰하였다. 자외선을 조사한 후 멜라닌화의 정도가 증가하는 것을 관찰할 수 있었으며 3가지 시험 물질을 도포하고 자외선을 조사한 후에 염증성 cytokine의 발현은 3T3 NRU PT 메서와 마찬가지로 8-methyoxypsoralen, 6-rnethylcournarin, tetracyclin의 순으로 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 시험 물질의 광독성도에 비례하여 cytokine의 발현량이 증가하고 여러 가지 cytokine 중 $IL-1{\alpha}$ 가 표준화된 실험실내 광독성 시험과 유사한 결과를 보이며 세포 생존도를 잘 반영하는 지표임을 알 수 있었다.
결론
멜라닌 세포가 포함된 인공 피부 모델은 자외선에 대한 반응이 피부와 유사하고 실험실적인 광독성 시험으로 인체의 피부를 대신하여 사용할 수 있는 실험실적인 모델로 생각된다.

Abstract ▼

Objective
Phototoxic reaction is a non-immunological reaction induced by the action of light on a photoactive chemicals. Recently many studies have been done for the usefulness of various kinds of reconstructed epidermis on dermal equivalent (3 dimensional culture of keratinocytes) as an in vitro

Objective
Phototoxic reaction is a non-immunological reaction induced by the action of light on a photoactive chemicals. Recently many studies have been done for the usefulness of various kinds of reconstructed epidermis on dermal equivalent (3 dimensional culture of keratinocytes) as an in vitro test of phototoxicity. However, in vitro phototoxicity test using reconstructed epidermis has not established yet as a standardized methods for phototoxicity test. In this study, not only keratinocytes but also melanocytes were cultured on the de-epidermized epidermis and usefulness of in vitro phototoxicity model for this human skin recombinants was examined.
Materials and Methods
The photobiological responses were observed in this human skin recombinants after exposure to various doses of UVA. Cytotoxicity were measured with neutral red uptake test and morphological changes.
The phototoxicities of three test chemicals, 8-methoxypsoralen(MOP), 6-methylcoumarin(MC) and tetracyclin(TC) were examined using 3T3 fibroblasts neutral red uptake phototoxicity test(NRU PT). Then these chemicals were applied to the human skin recombinants and after UVA irradiation, the degree of the phototoxicities was examined 10 the aspects such as cytotoxicity, epidermal morphological disturbance and proinflammatory cytokine releases. The degree of melanization and the changes of the expression of epidermal differentiational markers were also observed.
ResultsPhotobiological responses of the human skin recombinant were much similar to those of in vivo human epidermis. Relative resistances to UVB were observed. The increased melanization after UV A irradiation was noticed. Phototoxicities of three test chemicals were demonstrateded as the order of 8-MOP, 6-MC and TC in the 3T3 NRU PT. Increased phototoxicities were observed after application of test chemicals and UVA irradiation as the same ranks of tests in 3T3 fibroblasts. Morphological disturbances tended to be well correlated with the increased phototoxicity of tested chemicals. Steep increase of inflammatory cytokines according to the increase of phototoxicities were also noticed. $IL-1{\alpha}$ releases seemed to be the best index reflecting the degree of phototoxicity of tested chemicals.
Conclusion
The human skin recombinant contained with melanocytes may be a useful tool for the study of UV. induced cutaneous damage. It may be also promizing in vitro phototoxicity test model.

목차 Contents

• II. 총괄연구개발과제 연구결과...6
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...6
• 2. 총괄연구개발과제의 연구결과 내용 및 결과...11
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...25
• 4. 참고문헌...29
• 5. 총괄연구개발과제의 연구성과...33
• 6. 연구개발결과의 파급효과...38