보고서 정보
주관연구기관 |
중앙대학교 산학협력단 Chung Ang University |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2015-11 |
과제시작연도 |
2015 |
주관부처 |
식품의약품안전청 Korea Food & Drug Administration |
과제관리전문기관 |
식품의약품안전평가원 National Institute of Food and Drug Safety Evaluation |
등록번호 |
TRKO201600010703 |
과제고유번호 |
1475008545 |
사업명 |
안전기술 선진화 |
DB 구축일자 |
2016-10-29
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키워드 |
동물대체시험법.화장품.국소독성.과민반응.검증.alternative test method.cosmetics.local toxicity.sensitization.validation.
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DOI |
https://doi.org/10.23000/TRKO201600010703 |
초록
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- 본 연구사업단은 안전성 및 독성평가 연구 분야의 패러다임이 이전의 실험동물을 사용하는 in vivo, phenotype 기반의 고비용 연구에서 in vitro, 인체 조직을 이용하고 독성 기전 중심의 저비용 연구로 전환되고 있는 국제적인 동향에 대응하고 실험동물의 과잉 사용에 따른 사회적, 윤리적 문제를 해결할 수 있는 신규 동물대체시험법을 개발하고, 동물대체시험법의 검증 시스템을 국제 수준으로 표준화, 체계화하고 화장품 안전성평가에 응용하여 국내 화장품 안전성 및 독성 평가 분야의 첨단화, 국제화를 이루고 동물대체기술 개발의
- 본 연구사업단은 안전성 및 독성평가 연구 분야의 패러다임이 이전의 실험동물을 사용하는 in vivo, phenotype 기반의 고비용 연구에서 in vitro, 인체 조직을 이용하고 독성 기전 중심의 저비용 연구로 전환되고 있는 국제적인 동향에 대응하고 실험동물의 과잉 사용에 따른 사회적, 윤리적 문제를 해결할 수 있는 신규 동물대체시험법을 개발하고, 동물대체시험법의 검증 시스템을 국제 수준으로 표준화, 체계화하고 화장품 안전성평가에 응용하여 국내 화장품 안전성 및 독성 평가 분야의 첨단화, 국제화를 이루고 동물대체기술 개발의 국내 인프라 구축 및 우수 인력 양성을 하여 화장품 안전성평가 선진화를 달성하였음.
- 본 연구사업단의 연구과제는 3개의 중단위과제와 6개의 세부과제로 구성되어 연구 수행을 하였음.
- 본 연구사업단의 1중 단위과제는 인체 국소독성 중 인체 각막 모델을 이용한 안자극 동물대체시험법 및 인체 구강점막 모델을 이용한 구강점막자극 동물대체시험법을 신규 개발하고 개발한 시험법에 대한 표준화된 검증 연구를 통하여 국내 검증 연구 기반을 확립하고 국제 수준의 동물대체시험법을 확보하여 글로벌 수준의 화장품 안전성 평가 기반 구축을 하였음.
- 1중단위 1세부과제에서는 한국형 인체 각막모델 (MCTT HCE)을 이용하여 액체 및 고체 안자극 시험 물질들을 대상으로 세포생존율 측정을 end point로 한 안자극 시험법을 개발하고, 표준작업지침서를 확립하여 시험법을 최적화하였음. GLP 급 3개 참여연구실을 대상으로 시험법 전수 확인 후 6종 시험물질에 대한 숙련도 확인 실험 후 20개 참고 시험물질을 대상으로 한 실험실내 및 실험실간 일치도 평가시험을 통하여 시험법의 기술 이전을 완료 후 실험실내 재현성 85~95%, 실험실간 재현성 95%를 확보하였음. 총 130종의 참고 시험물질 (고체 50종, 액체 80종; 자극성 76종, 비자극성 54종)을 대상으로 한 3개 참여연구실들의 예측력 시험 후 통계분석을 통하여 35% 세포생존율을 기준으로 하여 민감성 93.4%, 특이성 77.8%, 정확성 86.9%의 결과를 얻어 최초 목표로 하였던 민감성, 정확성 80%를 초과달성하는 우수 결과를 확보하였음. 본 연구 결과는 국외 개발 안자극 평가를 위한 인체 각막 모델들의 민감성, 특이성, 정확성에 필적하는 결과로 한국형 인체 각막모델을 이용한 안자극 시험법의 개발이 성공적으로 수행되었음을 확인하였음. 시험법의 민감성을 보다 향상시키기 위해 고체 시험물질에 대한 시험법의 추가적인 개선이 필요할 것으로 판단됨. 안자극 시험법의 예측력을 증가하기 위한 신규 생체지표 발굴을 위한 오믹스 연구를 통하여 신규 생체지표후보로 cornifelin, early growth response-1를 transciptomics 분석을 통해 발굴하였으며 proteomics 분석을 통해 ezrin을 발굴하였고, LC-MS 기반의 metabolomics 분석을 통하여 nervonic ceramide를 확보하였으며 발굴된 신규 생체지표 후보들을 이용하여 안자극 시험법의 예측력을 향상시킬 수 있는 방안의 확보가 가능하게 되었음.
- 1중 2세부과제에서는 국내 개발 인체 인공 구강 점막 모델 (HOM IHOK)을 이용하여 5종의 시험 물질들을 대상으로 세포생존율을 end point로 한 구강점막자극 시험법을 개발하고, 표준작업지침서를 확립하여 시험법을 최적화하였음. 인체 구강 primary cell (HOM Primary)을 이용한 인공 구강모델을 국내 최초로 확립하고 품질의 개선을 이루었음. 구강자극 참고물질 20종 (고체 7종, 액체 13종; 자극성 14종, 비자극성 6종)을 대상으로 한 3개 참여연구실들의 예측력 시험 후 민감성 85.7% 이상의 결과를 얻어 시험법의 개선을 통한 예측력 향상이 가능한 것으로 판단됨. 구강점막세포주 (IHOK)를 이용한 구강 점막 자극시험법을 신규 확립하였으며 11종 구강 자극 참고물질을 대상으로 한 맹검 시험을 통하여 구강 점막 세포주를 이용한 점막 자극 평가 시험법의 개발 가능성을 확보하였음.
- 본 연구사업단의 2중 단위과제는 인체 감작성 평가를 위하여 인체 피부 모델을 이용한 피부감작성 동물대체시험법 및 인체 광과민성를 위한 신규 생체 지표 발굴 및 신규 광과민성 평가 모델을 개발하고 개발한 시험법에 대한 검증 연구를 통하여 선진국 수준의 화장품 안전성 평가 감작성 연구 기반을 구축하였음.
- 2중단위 1세부과제에서는 Local Lymph Node Assay: BrdU-Flow Cytometry Method를 신규 개발하여 검증연구를 종료하였으며, 국문 및 영문 검증 연구보고서 작성을 완료하였음. 한국형 인체 피부모델 (Keraskin-VM)을 이용하여 액체 및 고체 피부자극성 시험 물질들을 대상으로 세포생존율 측정을 end point로 한 피부자극 시험법을 개발하고, 표준작업지침서를 확립하여 시험법을 최적화하였음. GLP 급 3개 참여연구실을 대상으로 시험법 전수 확인 후 15종 참고 시험물질을 대상으로 한 예측력 시험에서 민감성 80%, 특이성 70%로 OECD 정확도 기준에 이르는 결과를 확보하였음. 본 연구 결과로 추가적인 시험법 개선을 통하여 한국형 인체 피부모델을 이용한 피부자극 시험법의 개발이 가능할 것임을 확인하였음. 각질세포주 (HaCaT)를 이용한 피부감작성 시험법 개발을 위한 표준작업지침서를 확립하여 시험법을 최적화하였음. 피부감작성 참고물질 12종 (비감작성 5종, 감작성 7종)을 대상으로 한 선도연구실 예측력 평가시험에서 민감성 85.7%, 특이성 80%, 정확성 83.3%의 결과를 얻었으며 22개 참고물질 (비감작성 6종, 감작성 16종)을 대상으로 한 3개 참여연구실의 검증 시험결과로 정확성 77.3~81.8%의 결과를 얻어 시험법의 개선을 통한 예측력 향상이 가능한 것으로 판단됨. 또한 피부자극성 및 피부감작성 평가를 위한 skin-on-a-chip device를 개발하여 피부 감작성 대체시험법으로 응용이 가능할 것으로 판단됨.
- 2중단위 2세부과제에서는 오믹스를 이용하여 광과민성 평가를 위한 신규 생체지표로 VEGF, IL-24, IL-8, OPG (osteoprotegerin)를 발굴하였으며 광과민성 물질에 의한 IL-24 발현 변화에 대한 신호전달 과정을 확립하였음. 각질세포주 (HaCaT)를 이용한 광과민성 시험법 개발을 위하여 시험법을 최적화하였음. 광과민성 참고물질 22종에 대한 VEGF와 IL-8 발현을 endpoint로 하는 선도연구실 예측력 평가시험에서 민감성 65%, 특이성 50%, 정확성 64%의 결과를 얻었으며 표준시험법이 없는 조건에서 신규 생체지표를 이용한 광과민성 평가가 가능할 수 있음을 확인하여 시험법의 개선을 통한 예측력 향상이 가능한 것으로 판단됨. 인체 피부 조직에 대한 오믹스 평가를 통하여 광독성 전사체 발현 DB를 확립하고 광자극성 신규 생체지표로 PI3 (elafin)을 발굴하였으며 THP-1과 HaCaT 세포의 공배양계를 이용한 광과민 시험법에 대한 표준작업지침서를 확립하고 시험법을 최적화하였음. 인체 일차 각막세포에 SV40-T antigen 및 인간유두종 바이러스 발암유전자인 HPV E6/E7을 도입하여 불멸화세포주를 확립하였으며 7종의 참고물질을 대상으로 한 세포생존력 시험으로 안자극 시험법으로의 가능성을 평가하였음.
- 본 연구사업단의 3중 단위과제는 동물대체시험법의 검증 및 평가 시스템을 구축하였음.
1중단위 및 2중단위에서 신규 개발된 동물대체시험법의 검증을 위한 국제 수준의 표준화 시스템을 개발하여 한국형 인체 각막모델을 이용한 안자극 대체시험법의 검증 연구에 성공적으로 적용하여 시험법의 검증 평가를 수행하였고, 통합독성평가 정보시스템 확립을 위한 웹기반 시험물질 검색 DB 프로그램 및 대체시험법 관련 독성 자료 DB를 구축하여 대체시험법 연구를 위한 정보 제공을 유용하게 하여 연구 기반을 구축하였음.
- 3중단위 1세부과제에서는 동물대체시험법 검증 (validation) 연구를 위하여 검증용 시험 물질 목록의 표준화를 확립하였음 (ChemEye DB, ChemSens DB). 안자극, 피부감작성 관련 가이드라인을 확립하고 검증 연구에 요구되는 통계기법을 확립하여 안자극 대체 시험법의 실험실내/실험실간 검증연구 결과에 대한 통계 분석, 예측력 평가 시험을 위한 검증용 시험물질의 표준화, 검증보고서 작성에 관한 표준화, 전문 평가 수행에 관한 표준화를 확립하였음. 검증관리를 위한 validation management team (VMT)의 구성, 운영, 관리에 대한 지침을 확보하였음. 표준화 시스템을 통해 검증 연구 관리를 수행하여 검증 연구를 위한 시험물질을 선정하여 시험기관에 공급하였고, 검증 결과에 대한 통계 분석 실시 및 통계 분석 보고서 작성, 전문평가팀을 통한 전문 평가 및 국제 전문가 자문을 거쳐 최종 국영문 검증 연구 결과보고서를 완성하여 국내 최초로 동물대체시험법 검증 연구를 위한 전 과정을 체계화하였음.
- 3중단위 2세부과제에서는 대체시험법에 사용될 수 있는 시험물질 입력을 위한 표준 서식을 개발하고, 관련 연구자들이 용이하게 검색할 수 있는 시험물질 검색을 위한 데이터베이스를 구축, 보완하였으며 300종의 시험물질의 입력을 완료하였음. 대체시험법 및 동물시험결과를 쉽게 검색할 수 있는 독성 자료 데이터베이스를 구축, 보완하였으며 독성 검색 사례를 제시하였음. OECD QSAR Toolbox의 사용법을 탑재하여 연구자들이 편리하게 이해하고 사용하도록 정보를 제공하였으며 OECD 가이드라인의 번역 및 자료집을 탑재하여 대체시험법 관련 연구자들이 신속하고 편리하게 최신 정보를 얻을 수 있도록 하여 대체시험법 연구를 위한 연구 기반을 확립하였음.
- 본 사업단의 연구 결과로 대체시험법 검증 연구를 위한 전체 과정이 국내 최초로 표준화, 체계화되었으며 피부감작성 대체시험법인 Local Lymph Node Assay: BrdU-Flow Cytometry Method를 신규 개발하여 검증연구를 종료하고 국문 및 영문 검증 연구보고서 작성을 완료하여 OECD에 시험법을 제안할 예정이며, 표준화된 시스템을 통한 안자극 대체시험법의 검증 연구를 수행하여 해외 안자극 모델들에 필적하는 평가 결과를 얻어 차후에 신규 OECD 시험법으로 제안할 수 있는 정보를 확보할 수 있었음. 국내 최초로 인체 인공 구강 점막 모델을 이용한 구강점막자극 시험법을 개발하여 대체시험법으로 제안하였으며, 한국형 인체 피부모델을 이용한 피부자극 시험법 및 각질세포주를 이용한 피부감작성 시험법 개발을 개발하고 최적화하였음. 세계 최초로 신규 생체지표를 이용한 광과민성 대체시험법을 개발하고 최적화하였음. 안자극 독성 평가를 위해 차후에 활용할 수 있는 유전체, 단백체, 지질 대사체 생체지표들을 신규 발굴하였고, 광과민성/광독성 평가를 위한 신규 생체지표들을 발굴하여 시험법에 적용하였음. 피부자극성 평가에 응용할 수 있는 skin-on-a-chip을 신규 개발하였으며, 안자극 및 피부자극성 시험법 개발에 사용할 수 있는 불멸화 세포주들을 확립하였음. 대체시험법 연구 활성화를 위한 시험물질 및 대체시험법 정보 제공 데이터베이스를 확립하여 국내 동물대체시험법 연구의 중요한 인프라를 확립하였음.
- 본 사업단의 연구 결과들을 통하여 화장품 안전성 평가를 위한 국제 수준의 독성 시험가이드라인을 확보하였으며 대체시험법을 이용한 국내 독성 평가 및 연구 기술 수준을 국제적 수준으로 향상할 수 있었음. 국내 독성 및 안전성 평가를 위한 연구 인프라를 확립하여 국내 관련 기업들의 국제경쟁력 강화에 기여하여 산업 경제 발전에 기여하였으며, 관련 연구 분야의 우수 연구 인력 양성 및 제공에 기여하였음. 결과적으로 본 연구사업단의 연구 활동을 통하여 국내 동물대체시험법 육성 기반을 마련하여 국민 건강과 국가경쟁력 강화에 크게 기여할 것으로 판단됨.
Abstract
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- CAMSEC (Consortium of Alternative Methods for Safety Evaluation of Cosmetics) has been developed new alternative methods for animal experiments and set-up standard protocols for validation research of alternatives based on the international standard. The achivements by CAMSEC significantly establi
- CAMSEC (Consortium of Alternative Methods for Safety Evaluation of Cosmetics) has been developed new alternative methods for animal experiments and set-up standard protocols for validation research of alternatives based on the international standard. The achivements by CAMSEC significantly establish the research infra for alternative method development and safety evaluation of cosmetics, provide good human resources for cosmetic industry. Based on these, CAMSEC strongly improve national scientific and technical bases for safety evaluation of cosmetics to international standard levels.
- CAMSEC was consisted of 3 middle level division and 6 sub-division research projects.
- I Mid-division research project of CAMSEC has been developed new alternative method for ocular irritation test using human corneal model and oral irritation test using human oral epithelial model. Developed alternative methods were continued to be evaluated by pre-validation test and validation test with standard protocols prepared by III-2 sub-division research team. From these, we set-up standard protocols for validation research of alternatives based on the international standard.
- By achieving I-1 subdivision research project, we has been developed ocular irritation test method using cellular viability as an end-point with various liquid or solid test chemicals. This ocular irritation test is using Korean corneal epithelium 3D culture model developed by MCTT (MCTT HCE model). we prepared the standard operation procedure (SOP) and optimized it. After transferring test protocols to 3 GLP-based research labs, testing techniques of each labs were reevaluated with 6 test chemicals. Intra-lab and inter-lab testing performance was measured with 20 test chemicals. Finally, validation researches were performed including GLP 3 labs to evaluate ocular toxicity of total 130 test chemicals (50 solids and 80 liquids; 76 irritants and 54 non-irritants). After appropriate statistical analysis of validation test results, we were able to get the results with 93.4% sensitivity, 77.8% specificity, and 86.9% accuracy based on 35% cut-off of cellular viability level which were better results than we previously had been expected (80% exprected level). These results were quite comparable to the other human ocular toxicity 3D methods which are frequently used for human ocular toxicity evaluation. Thus, we concluded that the development of alternatives for ocular toxicity using Korean corneal epithelium 3D culture model has been succcessful so far. Furthur refinement of test protocol for solid test chemicals will be needed to improve sensitivity. To improve the predictability of ocular irritation test method, new biomarkers were found using omics technology. Cornifelin and early growth response-1 were found using transcriptomic analysis, ezrin was selected as a protein biomarker using 2D gel electrophoresis-MS analysis. Nervonic ceramide was chosen as a lipid biomarker by LC-MS based metabolomic analysis. These biomarker candidates for ocular toxicity will be valuable to increase predictability of our ocular irritation test methods.
- By achieving I-2 subdivision research project, we has been developed oral irritation test method using cellular viability as an end-point with 5 test chemicals using Korean oral epithelium model developed by MCTT. We prepared the standard operation procedure (SOP) and optimized it. After transferring test protocols to 3 research labs, predictability tests were performed with 20 test chemicals (7 solids and 13 liquids; 14 irritants and 6 non-irritants) and 85.7% of sensitivity was achieved. Thus, after improving test protocols, the predictability is able to be increased. Oral irritation methods using immortalized human oral keratinocyte cells and using human oral primary epithelial cells were newly developed. Oral irritation test using immortalized human oral keratinocyte cells was performed with 11 test chemicals and the possibility developing new alterntives for oral irritation using these cell lines is evaluated.
- II Mid-division research project of CAMSEC has been developed new alternative method for skin sensitization test using human keratinocyte model and photosensitization test using human keratinocyte cell line. Developed alternative methods were continued to be evaluated by pre-validation test and validation test with standard protocols prepared by III-2 sub-division research team. From these, we set-up standard protocols for validation research of alternatives for sensitization based on the international standard.
- By achieving II-1 subdivision research project, we finalized development of Local Lymph Node Assay: BrdU-Flow Cytometry Method as skin sensitization method. Validation studies were completed. Skin irritation method has been developed using cellular viability as an end-point with various liquid or solid test chemicals. This skin irritation test is using Korean skin epithelium 3D culture model developed by MCTT (MCTT Keraskin-VM model). We prepared the standard operation procedure (SOP) and optimized it. After transferring test protocols to 3 GLP-based research labs, testing techniques of each labs were reevaluated. Predictability test with 15 test chemicals were performed including GLP 3 labs and we obtained the results with 80% sensitivity, 70% specificity. These results were reasonable for OECD standard level. Thus, we concluded that the development of alternatives for skin irritation using Korean skin epithelium 3D culture model will be succcessful. Using HaCaT human keratinocyte cell line, skin sensitization method was developed and predictability test with 12 test chemicals were performed and we obtained the results with 85.7% sensitivity, 80% specificity and 83.3% accuracy. Prevalidation studies also performed with 22 test chemicals and 77.3%~81.8% accurary were obtained. Furthur refinement of test protocol for solid test chemicals will be needed to improve accuracy. Skin-on-a-chip was designed for skin irritation and sensitization test.
- By achieving II-2 subdivision research project, we got various biomarker for photosensitization including VEGF, IL-24, IL-8, and OPG using omics analysis. Photosensitization test method has been developed using VEGF and IL-8 as end-points. Predictability test with 15 test chemicals were performed with 22 test chemicals and we obtained the results with 65% sensitivity, 50% specificity, and 64% accuracy. Because standard test methods for photosensitization was not developed, we developed photosensitization test methods using VEGF and IL-8 for the first time. Furthur refinement of test protocol for solid test chemicals will be needed to improve accuracy. Using human skin tissues, new biomarker PI3 was found for phototoxicity. By introducing HPV E6/E7 or SV40 T-antigen, immortalized cell line of human corneal cells and keratinocytes were successfully developed and are able to use to develop new test methods.
- By achieving III-1 subdivision research project, we set-up standard protocols of validation study on the international standard. Standardization of test chemical storage (ChemEye DB, Chemsen DB), articles, VMT process, and statistical analysis were established. By standard protocol prepared, validation study of human corneal 3D model (I-1 project) was successfully controlled. Thus, we concluded that we set-up all of the validation process for alternative methods for the first time in Korea.
- By achieving III-2 subdivision research project, we developed the standard input format for chemicals and established database for test chemicals and alternative methods. More than 300 chemicals were registered and the researcher can access the info about test chemicals and test methods easily. OECD QSAR Toolbox was introduced and user manuals were prepared. Guidebook for OECD test guidance was prepared. By these achivement, the infra system to study alternatives are significantly improved.
- During 3 year study, CAMSEC has been developed new alternative methods for animal experiments and set-up standard protocols for validation research of alternatives based on the international standard and prepare guidance for safety evaluation of cosmetics. The achivements by CAMSEC significantly improve national research bases for alternatives and toxicity to evaluate safety of cosmetics to international standard levels and these will be very helpful for enhancing human health and national competitiveness.
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제출문 ... 3
- 목차 ... 4
- Ⅰ. 연구사업단 최종보고서 요약문 ... 7
- 요약문 ... 8
- Summary ... 13
- Ⅱ. 사업단 연구결과 ... 17
- 1. 사업단과제의 최종 연구개발 목표 ... 18
- 1) 사업단과제의 목표 ... 18
- 2) 총괄연구개발과제의 목표달성도 ... 25
- 3) 국내ㆍ외 기술개발 현황 ... 27
- 2. 사업단 과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ... 67
- 3. 사업단 과제의 최종 연구개발 결과 ... 82
- 1) 제1중단위 ... 82
- 2) 제2중단위 ... 82
- 3) 제3중단위 ... 83
- 4. 사업단 과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 84
- 5. 사업단 과제의 연구성과 ... 90
- 1) 활용성과 ... 90
- 2) 활용계획 ... 100
- 끝페이지 ... 100
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