초록 ▼

HSV-1 thymidine kinase (TK)-deficient 돌연변이주와 세포배양체계를 이용하여 바이러스 잠복감염으로부터 재활성기전에 TK의 필수성 및 각 돌연변이 TK의 효소학적 시험결과는 다음과 같음.
- 9 종의 바이러스 TK유전자의 대장균내 발전체계를 확립하고 분리된 단백질로 효소활성을 조사하여, 돌연변이주들을 활성이 조금 남아 있는 TK-partial과 전혀 없는 TK-negative군으로 분류.
- TK-negative주는 thymidylate kinase 활성도 없음을 확인.
- 마우스 일차 배양

HSV-1 thymidine kinase (TK)-deficient 돌연변이주와 세포배양체계를 이용하여 바이러스 잠복감염으로부터 재활성기전에 TK의 필수성 및 각 돌연변이 TK의 효소학적 시험결과는 다음과 같음.
- 9 종의 바이러스 TK유전자의 대장균내 발전체계를 확립하고 분리된 단백질로 효소활성을 조사하여, 돌연변이주들을 활성이 조금 남아 있는 TK-partial과 전혀 없는 TK-negative군으로 분류.
- TK-negative주는 thymidylate kinase 활성도 없음을 확인.
- 마우스 일차 배양 신경세포와 PC-12세포에서 바이러스 잠복감면 유도 체계 확립.
- 잠복감염으로부터 재활성 유도시험결과 Vero세포와의 coculture법이 가장 적합함을 확인.
- 마우스 일차신경세포에서는 wild type의 재활성효율이 매우 낮으며 (<20%), TK-negative주는 더 낮음
- PC-12에서는 100% 재활성이 일어났으며, 모든 돌연변이주의 재활성관찰.
- HSV-1의 TK단백질은 감염 2 시간 후부터 감지되어, 세포가 죽을 때까지 세포핵에 다량존재.
- TK는 바이러스 증식과 무관하게 세포내 핵산 및 핵산유도체의 uptake를 크게 증가시킴
- 각 돌연변이주의 TK localization 시험결과 단백질이 소량 발현되는 TK 유전자의 mRNA 생성량은 정상임을 확인하여, nuclear transport signal주위의 돌연변이와 관련될 것을 추정.
- 바이러스로 감염된 세포추출물의 2D 전기영동 및 분석체계 구축
- LAT유전자의 클로닝과 염기서열을 결정.
- 잠복감염된 마우스삼차신경의 DNA와 RNA에서 LAT확인
- 마우스 감염모델에서 TK-negative바이러스의 조직 바이러스 역가가 낮음 확인
결론으로, HSV-1 TK돌연변이주들의 TK의 효소학적 특성에 TMPK활성여부를 첨가할 수 있었음.PC-12에서 모든 돌연변이주의 재활성이 관찰되었으나, PC-12세포가 마우스 일차 배양 신경세포와는 달리 cellular TK를 발현함을 확인하였기에 바이러스 TK가 재활성에 필수적이지 않다라는 결론은 내릴 수가 없었음. 대신에 바이러스 동물감염에서 TK가 병인성에 큰 영향을 끼침을 발견. 이는 동물 감염직후 선천면역을 회피기전 또는 세포내 바이러스 증식저해 기능회피기능 때문일 것으로 추측. 즉 TK활성의 결여로 바이러스가 초기에 제거되거나 세포내에서 증식을 못하기 때문일 것임.

목차 Contents

• 제 1 장 연구개발과제의 개요...17
• 제 1 절 연구개발의 목적...17
• 제 2 절 연구개발의 필요성...17
• 제 3 절 연구개발의 범위...18
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황...20
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과...26
• 제 1 절 연구내용...26
• 1. 시험관체계 연구...26
• 가. HSV-1 TK의 효소학적 연구...26
• (1) TK유전자 발현을 위한 HSV-1 돌연변이 TK유전자의 클로닝...26
• (2) recTK 단백질의 분리...26
• (3) 돌연변이 TK의 TMPK활성...26
• (4) TK저해제 탐색...26
• 나. LAT 유전자의 클로닝 및 염기서열 결정...26
• 2. 세포체계 연구...26
• 가. 세포체계 잠복감염과 재활성 모델구축 및 활용...27
• (1) 마우스 신경세포 일차 배양...27
• (2) 신경세포의 바이러스 잠복감염 유도 및 확인...27
• (3) 잠복감염된 신경세포로부터 재활성 유도 및 확인...27
• (4) 잠복감염된 신경세포로부터 재활성 유도 및 확인...27
• 나. TK와 세포내 물질의 상호작용 연구...27
• (1) 세포 추출물의 2D 전기영동...28
• (2) 세포내 thymidine 정량 및 유도체 분석...28
• (3) HSV-1의 cell tropism...28
• (4) HSV감염세포의 TK 단백질의 localization...28
• 3. 동물체계 연구...28
• 제 2 절 실험재료 및 방법...28
• 1. 실험재료...28
• 가. 세포...28
• 나. 바이러스...28
• 다. 박테리아...28
• 라. 시험동물...29
• 마. plasmid DNAs...29
• 바. 시험약물...29
• 2. 실험 방법...29
• 가. 세포주배양...29
• 나. 마우스 신경세포의 일차배양...30
• 다. 바이러스의 증식...30
• 라. 바이러스 역가측정...30
• 마. 항바이러스약효검색...30
• 바. 세포독성 검색...31
• 사. MTT검색법...31
• 아. 단백질정량...32
• 자. SDS/polyacrylamide 전기영동...32
• 차. 단백질 염색...32
• 카. TK 단백질의 Western 분석...33
• 타. 대장균내 TK유전자 발현과 TK단백질 분리 정제...33
• 파. Thymidine kinase 활성 측정...34
• 하. TMP kinase 활성 측정...35
• 갸. 유전자 조작...35
• 냐. 바이러스 DNA분리...35
• 댜. 유전자의 PCR 증폭...36
• 랴. DNA 염기서열 결정...36
• 먀. Herpes simplex virus의 DNA 클로닝...36
• 뱌. 마우스 조직내 바이러스 유전자 검출...36
• 샤. 세포추출물의 2D 전기 영동...38
• 야. 바이러스 감염세포내 단백질의 radio-labeling...39
• 쟈. TK의 intracellular localization...39
• 챠. Herpes simplex virus의 동물피부감염모델...40
• 캬. Herpes simplex virus의 mouse비강감염 모델...40
• 탸. 마우스의 대뇌감염...40
• 제 3 절 연구결과...41
• 1. 시험관체계 연구...41
• 가. HSV-1 TK의 효소학적 연구...41
• (1) TK 유전자 발현을 위한 H5V-1 돌연변이 TK 유전자의 클로링...41
• (2) recTK 단백질의 분리...41
• (3) recTK의 TMPK활성...44
• (4) TK저해제 탐색...46
• 나. LAT유전자의 클로닝 및 염기서열 결정...52
• 2. 세포체계 연구...63
• 가. 세포체계 잠복감염과 재활성 모델구축 및 활용...63
• (1) 마우스 신경세포 일차 배양...63
• (2) PC-12 세포 배양...63
• (3) 신경세포의 바이러스 잠복감염 유도 및 확인...63
• (4) 잠복감염된 신경세포로부터 재활성 유도 및 확인...71
• 나. TK와 세포내 물질의 상호작용 연구...76
• (1) HSV TK 단백질의 세포내 존재 위치...76
• (2) HSV감염 후 세포내 TK의 발현조사...76
• (3) 세포 추출물의 2D 전기영동...76
• (4) 세포내 thymidine 정량 및 유도체 분석...81
• 3. 동물체계 연구...90
• 가. 마우스 감염조직의 바이러스 역가...90
• 4. 결론...95
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도...98
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획...102
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보...103
• 제 7 장 참고문헌...104
• 특정연구개발사업 연구결과 활용계획서...108