초록 ▼

1. 연구의 현황
한천은 우리나라 해안 어디서나 쉽게 볼 수 있는 홍조류에서 추출되는 다당류로서 해마다 그 생산량이 약 3,600 ton(약 50억원 상당)에 이르고 있는 비교적 풍부한 수산자원의 하나라고 할 수 있다. 그러나, 실제 한천의 이용현황에 있어서는 전체 생산량의 약 6.5％정도만이 단순가공 처리되어 값싼 원료로 사용되어질 뿐, 대부분은 방치되어 환경오염을 야기시키고 있는 실정이며, 이러한 한천을 이용한 올리고당(oligesaccha.ides)은 단당이 glycoside결합에 의해 탈수축합된 중합도 2∼10 (분자량

1. 연구의 현황
한천은 우리나라 해안 어디서나 쉽게 볼 수 있는 홍조류에서 추출되는 다당류로서 해마다 그 생산량이 약 3,600 ton(약 50억원 상당)에 이르고 있는 비교적 풍부한 수산자원의 하나라고 할 수 있다. 그러나, 실제 한천의 이용현황에 있어서는 전체 생산량의 약 6.5％정도만이 단순가공 처리되어 값싼 원료로 사용되어질 뿐, 대부분은 방치되어 환경오염을 야기시키고 있는 실정이며, 이러한 한천을 이용한 올리고당(oligesaccha.ides)은 단당이 glycoside결합에 의해 탈수축합된 중합도 2∼10 (분자량은 300∼2000가량)의 소당류에 대한 총칭이며, 구성당의 종류에 따라 크게 homooligosaccharides와 heterooligosaccharides로 구분된다. 특히, 한천올리고당 특성은 저칼로리성, 충치예방효과, 변비개선효과, 혈당치개선에 의한 당뇨병 예방, 장내유익세균 증식인자로 작용하는 정균작용, 장내유해세균의 증식억제를 통한 정장작용, 혈중콜레스테롤 및 혈압 감소작용, 뛰어난 항균활성, 암세포 증식억제 작용, 면역활성 증가작용, 항 돌연변이능 등의 기능성 이 외에도 항산화기능등과 같은 인체의 건강을 유지하고 질병을 예방하는 기능과 보습력을 가지고 있어 건강보조식품, 의약보조제, 화장품 보습제, 식품 물성 개량제, 음료와 주류 첨가제 등으로 사용할 수 있다. 더욱이, 최근 들어 국민 식생활이 향상되고 건강에 대한 관심도가 증가됨에 따라 기능성 올리고당의 수요가 매년 증가하고 있으며, 새로운 기능성 올리고당의 신물질 개발 및 이를 이용한 다양한 제품개발에 관한 연구가 식품산업을 중심으로 활발히 진행되고 있다. 한천은 산ㆍ효소학적 가수분해에 의해 한천올리고당을 생성하게 되나, 산 가수분해의 경우 생성된 한천올리고당은 한천 고유의 비타민이나 무기질 등이 다량 파괴되어 올리고당의 기능성 및 안정성 유지등이 문제가 되어 한천올리고당의 생성을 위해서는 효소분해에 의한 방법이 보다 유용한 것으로 알려져 있다. 이러한, 한천가수분해효소는 각종 미생물로부터 생산되어지는데 이에 관한 연구는 Pseudomonas Sp., Vibrio sp., Cytophage sp., Actinomyces Sp. 등이 보고되어지고 있다 이들 미생물들은 대부분이 육상유래 미생물로 이루어져 있으며, 일부 해앙유래 미생물에 대해서 연구되어지고 있다. 하지만, 국내의 경우 해양미생물을 이용한 한천분해효소에 관한 연구는 현재까지 Kong 등, Kim 등, Lee 등에 의한 연구가 보고 되어지고 있을 뿐이다. 외국의 경우, 해조류를 이용한 올리고당의 생산에 관한 연구는 주로 일본을 중심으로 이루어져 왔다. 한천의 가수분해에 의해 얻어지는 neoagarooligosaccharide의 특성에 관해서 T. Kono 등은 전분노화의 억제 작용이 강하고, 난분해성으로 소화효소에 의해 분해되지 않으나 장내 유용 세균에 의해서 분해되며, 가열을 하면 정균작용을 나타내는 등 매우 유용한 물질이라고 보고하였다.
2. 연구의 목적
본 연구에서는 현재 값싸게 생산되는 한천을 이용하여 값비싼 생산물로 전환시켜 그 이용도 및 부가가치를 높이는데 그 목적을 두고 여러지역의 해양으로부터 한천분해능이 뛰어난 해양 미생물을 분리ㆍ동정, 최적배양조건, 분리ㆍ정제, 역가 및 생산성이 낮은 한천분해효소 생산균주를 생물공학적 기법을 이용한 균주개량을 통하여 개량함으로써 고 역가, 고 효율생산 공정 기술개발을 개발하고 고 기능성 한천올리고당을 대량생산할 수 있는 기초 자료를 확보하는데 그 목적이 있다.

목차 Contents

• 제 1 장 서론...11
• 제 1 절 연구의 현황...11
• 1. 연구의 현황...11
• 2. 연구의 목적...12
• 제 2 절 연구의 필요성...12
• 1. 기술적 측면...12
• 2. 경제적 측면...12
• 3. 사회ㆍ문화적 측면...13
• 제 3 절 국내ㆍ외 기술 현황...14
• 1. 국내의 기술현황...14
• 2. 국외의 기술현황...15
• 제 4 절 연구목표 및 범위...16
• 1. 1차년도의 연구목표...16
• 2. 2차년도의 연구목표...16
• 3. 3차년도의 연구목표...16
• 4. 연구진도표...17
• 제 2 장 생물공학적 기업을 이용한 한천분해효소 고 생산능을 이용한 한천분해효소의 고생산능을 지닌 변이주의 개발...19
• 제 1 절 서론...19
• 제 2 절 재료 및 방법...20
• 1. 돌연변이 유발에 의한 아가레이즈의 고생산성 균주의 개발...20
• 가. 돌연변이 균주의 선별...20
• 나. 최적배양조건...20
• 다. 효소의 분리 및 정제...20
• 라. 아가레이즈의 효소학적 특성조사...21
• (1) 최적온도 및 안정성...21
• (2) 최적 pH 및 안정성...21
• (3) 기질의 특이성...21
• (4) 정제된 효소의 $K_{m}$ 및 $V_{max}$...21
• (5) 청정제의 영향...21
• (6) 저해제의 영향...21
• (7) 금속이온의 영향...22
• (8) 케미칼의 영향...22
• (9) 환원제의 영향...22
• (10) 아미노산 조성의 분석...22
• (11) TLC를 이용한 한천올리고당의 분석...22
• 2. 유전자 클로닝을 이용한 아가레이즈의 고생산성 균주의 개발...22
• 가. E. coli에서의 아가레이즈의 발현...22
• 나. T7 프로모터를 이용한 아가레이즈의 발현 및 효소학적 특성조사...23
• 3. E. coli에서의 아가레이즈의 발현...23
• 4. T7 프로모터를 이용한 아가레이즈의 발현 및 효소학적 특성조사...23
• 5. 한천분해효소 대량생산을 위한 공정 개발...23
• 6. 한천올리고당 생산을 위한 효소 반응기 개발...23
• 7. 최적반응조건하에서 한천올리고당의 생산...24
• 8. 고농도기질 사용을 위한 한천 기질의 입방화...24
• 9. 한천올리고당 대량생산의 프로세스 개발...24
• 제 3 절 결과 및 고찰...24
• 1. 돌연변이 유발에 의한 아가레이즈의 고생산성 균주의 개발...24
• 가. 돌연변이주의 선별...24
• 나. 최적배양조건...25
• 다. 효소의 분리 및 정제...25
• 라. SDS-PAGE를 이용한 효소활성 측정...26
• 마. 아가레이즈의 효소학적 특성조사...32
• (1) 최적온도와 안정성...32
• (2) 최적 pH와 안정성...32
• (3) 기질의 특이성...32
• (4) 정제된 효소의 $K_{m}$ 및 $V_{max}$...36
• (5) 청정제의 영향...36
• (6) 저해제의 영향...36
• (7) 금속이온의 영향...39
• (8) 케미칼의 영향...39
• (9) 환원제의 영향...39
• (10) 아미노산의 조성의 분석...39
• (11) TLC를 이용한 한천올리고당의 분석...39
• 2. 유전자 클로닝을 이용한 아가레이즈의 고생산성 균주의 개발...45
• 가. 아가레이즈 유전자의 클로닝...45
• 나. 아가레이즈 유전자의 염기배열 결정 및 분석...45
• 다. 코돈 유세이즈 분석...48
• 라. 아미노산 조성 분석...53
• 마. 하이드로퍼시 분석...53
• 바. Ba41의 아미노산 비교...57
• 3. E. coli에서의 아가레이즈의 발현...57
• 가. 아가레이즈의 발현 플라스미드의 제조...57
• 4. T7 프로모터를 이용한 아가레이즈의 발현...58
• 5. 생산된 아가레이즈의 특성조사...62
• 가. 최적온도와 안정성...62
• 나. 최적 pH와 안정성...62
• 다. 기질의 특이성...62
• 라. 정제된 효소의 $K_{m}$ 및 $V_{max}$...66
• 마. 청정제의 영향...66
• 바. 저해제의 영향...66
• 사. 금속이온의 영향...70
• 아. 케미칼의 영향...70
• 자. 환원제의 영향...70
• 6. 한천분해효소의 대량생산을 위한 공정 개발...70
• 7. 한천올리고당 생산을 위한 효소 반응기 개발...73
• 가. 조효소의 제조...73
• 나. 고정화 효소의 제조...73
• 다. 고정화 비드의 크기별 제조...75
• 라. 고정화 지지체의 선정 및 최적농도...75
• 마. 고정화 비드의 크기별 전환율...78
• 바. 고정화 비드의 강도 측정...78
• 사. 고정화 효소의 활성에 미치는 온도의 영향...81
• 아. 고정화 효소의 활성에 미치는 pH의 영향...81
• 8. 최적 반응조건하에서 한천올리고당의 생산...84
• 가. 고정화 효소의 반응 속도 상수...84
• 나. 고정화 효소 반응기...84
• 다. PBR 반응기의 특성...84
• 라. 기질의 농도 및 공급속도 변화에 따른 영향...89
• 마. PBR 반응기의 운전 안정성...89
• 바. 한천올리고당의 성분 분석...89
• 사 반응시간에 따른 생성 올리고당의 조성변화...91
• 아. PBR을 이용한 한천올리고당의 생산...91
• 9. 고농도기질 사용을 위한 한천 기질의 입방화...91
• 가. 입방화 한천의 제조...91
• 나. 입방화 한천겔 농도에 따른 영향...95
• 다. 효소 농도에 따른 영향...95
• 라. 반응산물의 분석...95
• 마. 반응수율의 조사...95
• 10. 한천올리고당 대량생산 프로세스 개발...98
• 가. 한천올리고당의 경제성 검토...98
• 나. 한천올리고당의 생산 공정...98
• 다. 흐름도의 설계...101
• 라. 한천올리고당의 생산...101
• 마. 한천올리고당의 생산을 위한 공정설계...101
• 바. 스케일 업에 대한 설계기준의 설정...103
• 제 4 절 참고문헌...106
• 제 3 장 한천올리고당의 수율향상 및 원가절감을 위한 신 공정법의 개발...112
• 제 1 절 서론...112
• 제 2 절 재료 및 방법...115
• 1. 재료...115
• 2. 한천올리고당의 제조...115
• 가. 효소 분해법...115
• (1) 한천분해효소 생산 균주의 배지조성 및 배양조건...115
• (2) 한천분해효소의 분리...115
• (3) 한천분해효소를 이용한 한천올리고당의 제조...115
• 나. 산 가수분해법...115
• (1) 산의 종류에 따른 한천올리고당의 제조...115
• (2) 초산을 이용한 한천올리고당의 최적생산조건 검토...116
• 3. 한천올리고당의 분리 공정...116
• 가. 반응물의 여과...116
• 나. 한천올리고당의 회수...117
• (1) 동결건조에 의한 방법...117
• (2) 진공감압건조에 의한 방법...117
• 4. 한천올리고당의 분석...117
• 가. TLC에 의한 분석...117
• 나. NHR에 의한 분석...117
• 다. HPLC에 의한 분석...118
• 라. 전당량 측정...118
• 마. 환원당량 측정...118
• 5. 초산 가수분해법을 이용한 한천올리고당의 생산 공정도...118
• 6. 한천올리고당의 대량생산공정 개발...118
• 가. 대량생산공정을 이용한 한천올리고당 생산...118
• 나. 대량생산된 한천올리탐색...120
• 가. 균주의 선정...120
• (1) 병원성 균주...120
• (2) 장내 유용 세균...120
• 나. 균주의 배양특성...120
• (1) 병원성 균주의 배지 및 배양방법...120
• 다. 장내 유용 세균의 배양조건...120
• (1) 배양배지...120
• (2) 배양방법...120
• 라. 항균활성의 측정법...121
• 마. 장내 유익세균 증식효과 측정...121
• 제 3 절 결과 및 고찰...123
• 1. 산의 종류에 따른 한천올리고당의 제조...123
• 가. 강산 가수분해법에 의한 제조...123
• 나. 약산 가수분해법에 의한 제조...123
• 2. 효소 분해산물과 산 분해산물의 구성성분 비교...123
• 3. 초산을 이용한 한천올리고당의 최적생산조건 검토...124
• 가. 최적 기질 농도의 결정...124
• 나. 최적 초산 농도의 결정...124
• 다. 가열방법에 따른 한천올리고당의 제조법의 비교...124
• 라. 기질 전처리 유무에 따른 비교...124
• 4. 한천올리고당이 장내 세균에 미치는 영향 탐색...130
• 가. 균주의 선정...130
• (1) 병원성 균주...130
• (2) 장내 유용 세균...130
• 나. 병원성 균주의 배양조건...130
• (1) 배양배지...130
• (2) 배양방법...130
• 다. 장내 유장 세균의 배양조건...133
• (1) 배양배지...133
• (2) 배양방법...133
• 라. 장내 유해 세균에 대한 항균 활성 측정...133
• 마. 장내 유익 세균 증식효과 측정...138
• 5. 최적반응 프로세스 및 대량분리 공정법의 개발...138
• 가. 중화에 따른 영향...138
• 나. 진공감압건조에 의한 분리방법...138
• 다. 동결건조에 의한 분리방법...140
• (1) 동결건조된 한천올리고당의 전당량 측정...140
• (2) NMR 분석...140
• 6. 한천올리고당의 대량생산공정 개발...140
• 가. 초산 가수분해법을 이용한 한천올리고당의 생산공정도...140
• 나. 대량생산공정...140
• 다. 생산된 한천올리고당의 분석...140
• 7. 한천올리고당의 경제성 검토...145
• 8. 스케일 업에 대한 설계기준 설정...148
• 제 4 절 참고문헌...149
• 제 4 장 한천올리고당 생산 파일럿의 제작 및 산업화 기술개발...152
• 제 1 절 서론...152
• 제 2 절 재료 및 방법...154
• 1. 한천분해효소를 이용한 한천올리고당 생산 프로세스의 검증 및 보완...154
• 2. 유기산 가수분해법에 의한 한천올리고당 생산 프로세스의 검증 및 보완...154
• 3. 프로세스의 설계 및 제작...154
• 4. 시제품 생산...154
• 제 3 절 결과 및 고찰...154
• 1. 한천분해효소를 이용한 한천올리고당 생산 프로세스의 검증 보완...154
• 2. 유기산 가수분해법에 의한 한천올리고당 생산 프로세스의 검증 및 보완...155
• 3. 프로세스의 설계 및 제작...155
• 4. 시제품 생산...158
• 5. 향후 추진 계획...158
• 제 4 절 참고문헌...163
• 해양수산부 해양수산중소ㆍ벤처기업기술개발지원사업 사업결과 보완사항...164