초록 ▼

연구목적:
뇌졸중을 비롯한 난치성 신경계통 질환과 밀접한 관계에 있는 신경세포 사멸 기전을 밝히고, 이를 방지하기 위한 전략을 체계적으로 확립하기 위하여 3세부과제로 구성하였다. 허혈 손상에 민감한 신경세포와 저항하는 세포의 종류 및 그들의 신경생화학적 특성 규명, 저항하는 신경세포에서 칼슘 완충기전 규명 및 허혈 손상에서 아교세포의 역할 규명 등 허혈 손상에 의한 신경세포사멸 기전을 종합적으로 이해하고 이에 대한 치료전략을 수립하는 것이 본 연구과제의 수행 목적이다.
연구방법:
1. 허혈 손상에 민감한 신경세포와

연구목적:
뇌졸중을 비롯한 난치성 신경계통 질환과 밀접한 관계에 있는 신경세포 사멸 기전을 밝히고, 이를 방지하기 위한 전략을 체계적으로 확립하기 위하여 3세부과제로 구성하였다. 허혈 손상에 민감한 신경세포와 저항하는 세포의 종류 및 그들의 신경생화학적 특성 규명, 저항하는 신경세포에서 칼슘 완충기전 규명 및 허혈 손상에서 아교세포의 역할 규명 등 허혈 손상에 의한 신경세포사멸 기전을 종합적으로 이해하고 이에 대한 치료전략을 수립하는 것이 본 연구과제의 수행 목적이다.
연구방법:
1. 허혈 손상에 민감한 신경세포와 저항하는 세포의 종류 및 신경생화학적 특성을 면역화학염색법과 전자현미경적 방법으로 규명
2. glutamate에 의한 retinal neuron $Ca^{2+}$ 신호의 완충기전을 분리한 gold fish와 흰쥐 신경세포에서, 허혈 후 흰쥐 망막 신경세포에서 glutamate에 의한 $Ca^{2+}$완충기전을 digital $Ca^{2+}$ imaging, microfluorophotometric system, confocal microscope을 사용해 규명
3. 허혈 손상 시 망막 내 아교세포에서의 JAK-STAT 신호전달과정 활성화 기전을 면역화학염색법과 Western blot법 등의 방법으로 규명
연구결과:
Ⅰ.허혈 손상 시 민감한 세포와 저항하는 세포의 종류 및 신경생화학적 특성 연구
Ⅰ-1. 허혈 손상에 민감한 세포의 종류 및 특성
허혈 망막에서 PCNA를 발현하는 세포는 Mueller 세포임을 알 수 있었으며, PCNA 발현세포는 TUNEL에 양성반응을 나타내지 않았다.
허혈 망막에서 apoptosis로 사멸하는 세포는 신경절세포층과 속핵층에서 관찰되었다. apoptosis 관련 clusterin은 초기에 Mueller 세포에서, 후에 광수용세포에서 발현되었다. 이로써 허혈 손상에 대하여 PCNA를 발현하는 세포는 TUNEL에 반응을 나타내지 않으며, clusterin을 발현하는 일부의 Mueller 세포는 apoptosis로 사멸함을 관찰하였다.
I-2. 허혈 손상에 저항하는 세포의 종류 및 특성
허혈 손상 시 망막 수평세포에서 칼슘결함단백질인 calbindin과 칼슘의 세포내 신호전달과 관련하여 신경세포 이주에 역할을 하고 있는 doublecortin (DCX)의 단일 및 이중 면역염색을 통하여, 두 종류의 단백질이 허혈 손상에 대한 수평세포의 저항성 기전에 관계함을 알 수 있었다. 재순환 후 시간 경과에 따른 두 단백질 양적 변화는 서로 달라 다른 중간 경로를 통하여 저항성 기전에 관여하는 것임을 시사하였다.
Ⅱ. 허혈 손상 시 망막 신경 세포의 $Ca^{2+}$완충기전 연구
II-1. gold fish에서 분리한 망막 신경세포의 glutamate에 의한 세포 내 $Ca^{2+}$ 농도의 완충 기전 규명
gold fish에서 glutamate로 자극하면 glutamate농도에 의존적으로 세포내 $Ca^{2+}$농도가 증가후 glutamate를 제거하면 감소하는데 감소가 자극전보다 더 아래 낮은 상태로 유지되다 다시 정상 안정상태로 되돌아가는 특이한 현상이 존재함을 발견하였다. 이 기전에는 $Na^{+}$/$Ca^{2+}$ exchanger와 membrane potential의 변화가 관여함을 규명하였다.
II-2. 흰쥐 망막 신경세포의 glutamate에 의한 세포 내 $Ca^{2+}$농도의 완충 기전 규명
ischemia가 흰쥐 망막에 가해지면 망막세포 중 horizontal cell이 많이 생존하며, 이 생존한 세포에서 calbindinD28k가 과발현된다는 사실을 망막세포를 분리해서 확인하였다. 분리한 망막세포를 배양해서 oxygen-glucose deprivation의 ischenia를 가하면 망막신경세포 사멸이 일어났다. 이 horizontal cell에서 calbindinD28k가 많이 발현되는 지와 ischemia를 받은 세포에서 calbindinD28k가 과발현된 세포를 glutamate 자극시 세포내 calcium signalling의 변화를 관찰하고 있다.
III. 허혈 손상 시 망막 아교세포에서 STAT3 발현
III-1. 허혈 망막 Mueller 세포에서 STAT3의 발현
허혈 손상 시 Mueller 세포에서 ciliary neurotrophic factor (CNTF) 신호전달경로 물질이 STAT3이 발현됨을 확인하였다. CNTE가 허혈 망막 Mueller 세포에서 발현됨은 이미 보고되었으므로, 이 CNTF의 신호가 autocrine 방식으로 자체 세포에 영향을 미침을 알 수 있는 결과였다.
III-2. CNTF, STAT3 발현 Mueller 세포의 사멸 여부 확인
허혈 손상에 대하여 신경사이토카인을 분비하여 주위 신경세포의 생존에 영향을 미치는 것으로 알려진 CNTF가 자체 세포 내에서 활성화되는 것으로 관찰됨에 따라, 자체 세포 내에 미치는 효과를 점검하기 위하여 TUNEL법을 시행한 결과, STAT3 발현 Mueller 세포는 TUNEL법에 양성반응을 나타내지 않으므로, STAT3 경로를 통하여 자체 세포의 생존에도 관계함을 시사하였다.

Abstract ▼

Aim:To investigate the mechanism of neuronal death and establish a protective strategy from neuronal degeneration by a variety of incurable neurodegenerative diseases, we performed three experiments by which identify and characterize the cellular types being resistant and sensitive to ischemia, char

Aim:To investigate the mechanism of neuronal death and establish a protective strategy from neuronal degeneration by a variety of incurable neurodegenerative diseases, we performed three experiments by which identify and characterize the cellular types being resistant and sensitive to ischemia, characterize the buffering mechanism in ischemia-resistant cells in vitro. In addition, we determine the role of glial cells in ischemia-induced cell death.
Methods:
1. The cellular types and their biochemical characteristics of neurons being resistant or susceptible to ischemia-reperfusion injury was assayed by immunocytochemistry using antibodies against PCNA, clusterin, calbindin, and doublecortin (DCX) , TUNEL method, and electron microscopy.
2. $Ca^{2+}$ buffering mechanism was assayed by digital $Ca^{2+}$imaging, microfluorophotometric measurement, immuohistochemistry of calbindin D28k, and whole cell patch clamping methods.
3. The glial types being expressed ciliary neurotrophic factor (CNTF) and CNTF activation via JAK -STAT signaling pathway in response to ishcemia was assayed by immunohistochemical methods and Western blot analysis.
Results:
1. The identity and characteristics of the retinal neurons being resistant and susceptible to ischemia
1-1. The retinal neurons being susceptible to ischemia: Retinal Mueller cells were expressed PCNA, and these PCNA expressing cells were not positive to TUNEL. Apoptotic cells detected by TUNEL method were located in the ganglion cell layer and the inner nuclear layer Clusterin, an apoptotic-associated glycoprotein, was expressed in the Mueller cells in earlier stage, and in the photoreceptors in later. Mueller cells expressing clusterin also showed TUNEL positivity, and therefore were underwent apoptotic death in response to ischemic injury.
1-2. The retinal neurons being resistant to ischemia: Retinal horizontal cells were resistant being contained the calcium binding protein, calbindin in ischemia, DCX is a microtubule-associated phosphoprotein and is involved in neuronal migration through $Ca^{2+}$-dependent signaling, A single or double immunofluorescent methods were demonstrated that these two molecules are involved in the resistant potency of horizontal cells to ischemia, These molecules are engaged in different pathway for the resistant mechanism, as analysing by time course of quantitative changes in ischemia-reperfusion injury.
II. $Ca^{2+}$ buffering mechanism in retinal neuronal cells during ischemia
II-1. Buffering mechanism of glutmate-induced calcium signalling in gold fish retinal horizontal cells: When cells were exposed to higher glutamate (> 100 μM) for more than 3 min, glutamate-induced increased [$Ca^{2+}$] levels decreased below the original resting level immediately after removal of glutamate. The decreased [$Ca^{2+}_i$] levels following removal of glutamate recovered to the resting level after rebound [$Ca^{2+_i}$] transient. The [$Ca^{2+_i}$] response was mdiated through activation of AMP A receptor. The glutamate-induced decreased and retrurning to basal [$Ca^{2+}_i$] levels were mediated through Na¹/$Ca^{2+}_i$ exchanger blocker, inhibited the [$Ca^{2+}_i$] decrease, Collectively, these results suggest that after prolonged exposure,
II-2. Buffering mechanism of glutmate-induced $Ca^{2+}$ signalling in cultured or isolated rat retinal horizontal cells: Retinal horizontal cells were resistant to in vivo rat retinal ischemia and calbindinD28k were expressed in the isolated resistant horizontal cells. Glutamate induced [$Ca^{2+}_i$] increase in cultured rat retinal cells at more than 5 day after culture. Ischemia with oxygen-glucose deprivation(OGD) induced cell death. We are still investigating whether OGD induced overexpression of calbindinD28k in the jschemia-resistant horizontal cells and glutmate induces smaller [$Ca^{2+}$] signalling in ischemia-resistant horizontal cells.
III. STAT3 expression in retinal Mueller cells to ischemia
III-1. STAT3 expression in retinal Mueller cells to ischemia: STAT3 is a signaling molecule being engaged in signal transduction of IL-6 family cytokines such as CNTF. It was already reported that CNTF is expressed in the Mueller cells in normal and ischemic retina, STAT3 is expressed in the Mueller cells in the ischemic retina in this study. Thus, CNTF may be signaled into the Mueller cells via STAT3 pathway in response to ischemia.
III-2. Apoptosis of CNTF and STAT3 expressing Mueller cells to ischemia: CNTF released by Mueller cells is engaged to cell survival of neighboring neurons to ischemic injury, The effect of CNTF to Mueller cells via STAT3 pathway is checked by TUNEL m,ethod. TUNEL postivity appeared in some Mueller cells of ischemic retina, and STAT3 activated Mueller cells were not positive to TUNEL. These results indicate that some Mueller cells die by apoptosis, and STAT3 expressing Mueller cells are survived in ischemia.

목차 Contents

• Ⅱ. 총괄연구개발과제 연구결과...9
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...9
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...21
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...49
• 4. 사업화 목표 달성도 및 계획(개발과제만 해당)...54
• 5. 총괄연구개발과제의 연구성과...55
• 6. 연구개발결과의 파급효과...72
• 7. 첨부서류...73
• Ⅲ. 제 1 부연구개발과제 연구결과 (세부과제별로 작성)...123
• 1. 제 ○ 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...124
• 2. 제 ○ 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...127
• 3. 제 ○ 세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...130
• 4. 제 ○ 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...138
• 5. 제 ○ 세부연구개발과제의 연구성과...140
• 6. 참고문헌...145
• Ⅲ. 제 2 세부연구개발과제 연구결과 (세부과제별로 작성)...148
• 1. 제 ○ 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...149
• 2. 제 ○ 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...150
• 3. 제 ○ 세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...151
• 4. 제 ○ 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...161
• 5. 제 ○ 세부연구개발과제의 연구성과...163
• 6. 참고문헌...167
• Ⅲ. 제 3 세부연구개발과제 연구결과 (세부과제별로 작성)...169
• 1. 제 ○ 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...170
• 2. 제 ○ 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...172
• 3. 제 ○ 세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...174
• 4. 제 ○ 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...179
• 5. 제 ○ 세부연구개발과제의 연구성과...181
• 6. 참고문헌...185