초록 ▼

1. Greenstatin 대량생산을 위한 Large scale에서의 최적 배양 및 정제 조건 확립
o 75 L 규모 고농도 배양공정 확립. 300 L 규모의 발효기를 이용한 배양공정 scale-up
o 평균 300 mg/L 이상 발현, 총 170 g의 Greenstation 발현
o 200L 배양에서 나온 40L 배양액 정제조건 확립, 10 batch 실시, 평균 4g/batch 생산 (수율 $50\%$)
2. Greenstatin의 안정성 확립
o Greenstatin의 특성에 적합

1. Greenstatin 대량생산을 위한 Large scale에서의 최적 배양 및 정제 조건 확립
o 75 L 규모 고농도 배양공정 확립. 300 L 규모의 발효기를 이용한 배양공정 scale-up
o 평균 300 mg/L 이상 발현, 총 170 g의 Greenstation 발현
o 200L 배양에서 나온 40L 배양액 정제조건 확립, 10 batch 실시, 평균 4g/batch 생산 (수율 $50\%$)
2. Greenstatin의 안정성 확립
o Greenstatin의 특성에 적합한 안정성 시험을 위한 분석 조건확립; 장기 안정성 및 가혹실험
o 안정한 액상 제제 조건 확정: 15mg/ml, 최소 3개월 간 안정
o 고농도 시료를 위한 동결건조 제제 조건 확정, 100 mg/ml, 최소 1 개월 간 안정
3. Greenstatin의 신혈관 형성 억제효능 검증
o 혈관내피세포 증식 억제 효능, 혈관내피세포 이동 억제 효능, 혈관내피세포 튜브(tube)형성 억제 효능 확인
o CAM assay, Matrigel plug assay 통하여 효능 확인
4. Greenstatin의 항암 효능 검증
o B16-F10 melanoma의 폐 전이 억제
o Nude mouse에 이종이식한 인간 전립선암(PC-3)의 성장 억제
o Nude mouse에 이종이식한 인간 폐암(A549)의 성장 억제
o Nude mouse에 이종이식한 9L gliosarcoma 의 성장을 억제, 생존기간 연장. 피부전이와 폐전이가 억제 또는 지연
5. 전임상 및 임상실험
o 암전이 방지제로 개발하기 의한 용량(5mg/kg), 투여경로(IV) 설정
o 단회투여독성시험, 면역독성시험, 유전독성시험 (복귀돌연변이, 염색체이상, 소핵시험) 진행중

Abstract ▼

In this research project a novel kringle-structured protein ($Greenstatin^{TM}$, 86 amino acids, m.w. 9,676), found from the kringle domains of apolipoprotein(a), was investigated to develop the anti-cancer drug based on anti-angiogenesis. The structural gene of Greenstatin was cloned int

In this research project a novel kringle-structured protein ($Greenstatin^{TM}$, 86 amino acids, m.w. 9,676), found from the kringle domains of apolipoprotein(a), was investigated to develop the anti-cancer drug based on anti-angiogenesis. The structural gene of Greenstatin was cloned into the expression system of methylotrophic yeast and it was found Greenstatin was efficiently secreted into culture medium. The recombinant methylotrophic yeast grew easily to the high/cell density and the recombinant Greenstatin was secreted up to about 300 mg/L. Greenstatin in the culture medium was purified with simple steps such as expanded-bed column chromatography and the overall purification yield was about $50\%$. To establish the platform for the commercialization and to supply samples for pre-clinical/clinical trial, the cultivation and purification system for producing the recombinant Greenstatin was scaled up successfully to 300L-scale without the decrease in the amount of secretion and the purification yield of Greenstatin. Studies on the stability of the purified recombinant Greenstatin and establishment of formulation such as liquid and lyophilized forms were performed simultaneously.
It was demonstrated that Greenstatin inhibited the proliferation, migration, tube formation of endothelial cell (HUVEC) and those inhibition effects was also shown from CAM assay and Matrigel plug assay. Finally, it was observed that Greenstatin inhibited effectively the growth of brain cancer cell (9L), lung cancer cell (A549), and prostate cancer cell (PC-3) in nude mice and additionally lung metastasis (B16-F10 experimental metastasis).

목차 Contents

• 표지...1
• 제출문...2
• 보고서 초록...4
• 요약문...6
• SUMMARY...8
• CONTENTS...10
• 목차...12
• 제 1 장 연구개발과제의 개요...14
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황...22
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과...28
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도...138
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획...144
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보...148
• 제 7 장 참고문헌...154
• 특정연구개발사업 연구결과 활용계획서...160