초록 ▼

$\bullet$ 단클론항체 의약품의 in vitro 역가시험법을 확립하기 위한 세포주를 개발하기 위해 현재 개발된 인간화 항체를 기준으로 임상에서 그 응용범위가 넓고 거부 반응이 가장 적은 TNF-alpha와 Her-2/ErbB2에 대한 항체 의약품을 선발하였다.
$\bullet$ GFP 형광 단백질을 reporter로 이용하는 lentiviral plasm 제작: GFP을 발현 하는reporter plasmid에 TNF-alpha에 의해 활성이 조절되는 전사인자 NF-kB 염기 서열을

$\bullet$ 단클론항체 의약품의 in vitro 역가시험법을 확립하기 위한 세포주를 개발하기 위해 현재 개발된 인간화 항체를 기준으로 임상에서 그 응용범위가 넓고 거부 반응이 가장 적은 TNF-alpha와 Her-2/ErbB2에 대한 항체 의약품을 선발하였다.
$\bullet$ GFP 형광 단백질을 reporter로 이용하는 lentiviral plasm 제작: GFP을 발현 하는reporter plasmid에 TNF-alpha에 의해 활성이 조절되는 전사인자 NF-kB 염기 서열을 함유하는 plasmid를 제작하였다. pTRF-mCMV-dscGFP vector의 MCS 부위에 NF-kB 서열을 EcoR I /spe I site를 이용하여 cloning 하였다.
$\bullet$ TNF-alpha에 의해 조절되는 lentiviral luciferase reporter plasmid 제작: luciferase을 발현하는 reporter plasmid에 TNF-alpha에 의해 활성이 조절되는 전사인자 NF-kB 염기 서열을 함유하는 plasmid 제작하였다 pTRF-mCMV-luc vector의 MCS 부위에 NF-kB 서열을 EcoR I /Spe I site를 이용하여 cloning 하였다.
$\bullet$ ErbB2 cDNA를 포함하는 retroviral plasmid 제작 : Clontech사의 MSCV-retroviral plasmid에 hErbB2 cDNA를 Bgl II/Xho I site를 이용하여 cloning 하였다.
$\bullet$ 형질전환 세포주의 개발: MCF-7 과 U937 세포에 TNF-alpha에 의해 EGFP 단백질의 발현이 조절되는 stable cell line 과 TNF alpha 에 의해서 luciferase 단백질이 조절되는 세포주을 각각 제작하였다. 세포주에 따른 TNF alpha 에 의한 luciferase의 발현을 비교 하였을 때 MCF-7 세포주가 U937 세포주 보다 TNF alpha 에 대해 반응성이 뛰어갔다. 또한 GFP 형광 단백질의 발현을 형광을 이용하여 측정한 방법 보다 Luciferase assay에 의한 TNF-alpha 반응성이 보다 정량적으로 나타났다. 그래서 단클론항체의 역가는 MCF-7 세포주를 사용하여 Luciferase assay에 기반 한 방법으로 평가하였다. 또한 인체 유선세포주 (MCF-10A)를 이용한 Her-2/Erb32 과다발현 cell line 확립은 ErbB2 발현과 함께 그 발현이 증가하는 GFP 형광단백질의 형광을 형광현미경으로 측정하였다.
$\bullet$ 형질전환 세포주를 이용한 역가산출 방법 개발: TNF-alpha 단클론항체의 역가를 평가하기 위하여 두 종의 항체(Chemicon 사, abcam 사)를 사용하였다 TNF alpha 에 대한 단일항체의 민감도 평가를 위한 최저 유의적 저해 농도는 0.1 ug/ml 이며, 5 ug/ml의 농도 이상에서는 완벽하게 저해함을 확인하였다. ($IC_{50}$ : 0.31 ug/ml). 두 종의 항체 모두 비슷한 저해 효과가 있음을 확인하였다. Her-2 과발현 형질전환세포의 경우 Her-2의 최종 target protein인 ERK의 인산화 정도를 정량하여 단일클론 항체의 역가를 평가하였으나 이용한 두 종의 항체에 의하여 EGF에 의한 ERK 인산화는 영향을 받지 않았다.
$\bullet$ 이상의 결과로부터 단클론항체 의약품의 in uitro 역가시험법을 확립하기 위해 염증치료 관련 TNF-alpha 표적 단클론 항체의 평가를 위한 형질전환 세포주의 개발과 종양치료 관련 Her-2 표적 단클론 항체 평가를 위한 형질전환 세포주을 개발하였다.

Abstract ▼

$\bullet$ In order to establish new cell lines for the in vitro efficacy test of monoclonal antibodies, we selected monoclonal antibodies against TNF-alpha and Her-2/ErbB2.
$\bullet$ Construction of rentiviral plasmid containing TNF-alpha-inducible GFP-reporter gene: NF-kB r

$\bullet$ In order to establish new cell lines for the in vitro efficacy test of monoclonal antibodies, we selected monoclonal antibodies against TNF-alpha and Her-2/ErbB2.
$\bullet$ Construction of rentiviral plasmid containing TNF-alpha-inducible GFP-reporter gene: NF-kB responsive elements were subcloned into the pTRF-mCMV-dscGFP vector (GFP-reporting rentiviral plasmid).
$\bullet$ Construction of rentiviral plasmid containing TNF -alpha-inducible luciferase-reporter gene: NF-kB responsive elements were subcloned into the pTRF-mCMV-dscLuc vector
(Luciferase-reporting rentiviral plasmid).
$\bullet$ Construction of retroviral plasmid containing hHer-2/ErbB2 gene: hErbB2 cDNA was subcloned into MSCV-retroviral plasmid (Clontech).
. Establishment of stable cell lines: MCF-7 and U937 celIs were infected with rentiviral particles (pTRF-mCMV-dscLuc or pTRF-mCMV-dscGFP). The intensity of infection was monitored by GFP-fluorescence or lumenescence after exposure of both the celIs to TNF-alpha. Among the established ceIl lines, reporting sensitivity to TNF-alpha was outstanding in luciferase-reporting MCF-7 celIs. Hence, we performed efficacy test of monoclonal antibodies using MCF-7 celIs infected with pTRF-mCMV-dscLuc viral particles. In addition, we established MCF -l0A cells (a human mammary epithelial cell line) stably overexpressing Her-2/ErbB2 gene by retroviral gene delivery technique.
$\bullet$ Efficacy test of monoclonal antibodies using the developed cell lines: To estimate the efficacies of monoclonal antibodies, we used two kinds of monoclonal antibodies in each ceIl line. TNF-alpha-inducible luciferase reporter activity was completely inhibited by above 5 ug/ml T NF-alpha monoclonal antibody (Chemicon) and the mininal effective concentration is 0.1 ug/ml ($IC_{50}$ = 0.31 ug/ml). The inhibitory efficacy of AbCam antibody was comparable to that of Chemicon antibody. We also estimated the efficacies of Her-2/ErbB2 monoclonal antibodies in ErbB2-overexpressing MCF-10A celIs, which was determined by ERK phosphorylation intensity. However, two different Her-2/ErbB2 monoclonal antibodies did not affect the phosphrylation increase of ERK in response to EGF.

목차 Contents

• 용역연구사업 연구결과보고서...1
• 표지...2
• 연구결과보고서...3
• 제출문...4
• 목차...5
• I. 연구개발결과 요약문...6
• 한글요약문...6
• 영문요약문...7
• II. 총괄연구개발과제 연구결과...8
• 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...8
• 1.1 총괄연구개발과제의 목표...8
• 1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도...13
• 1.3 국내?외 기술개발 현황...13
• 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법...17
• 2.1 연구내용...17
• 2.2 연구방법...21
• 제3장 총괄연구개발과제의 치종 연구개발 결과...24
• 3.1 TNF-alpha 단클론항체 역가평가용 세포주의 개발...24
• 3.2 ErbB2 단클론항체 역가평가용 세포주 개발...36
• 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...39
• 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과...41
• 5.1 활용성과...41
• 5.2 활용계획...42
• 제6장 주요변경사항...43
• 제7장 참고문헌...44
• 제8장 첨부서류...45
• 총괄 연구과제 요약...46