초록 ▼

본 연구과제에서는 임상적용을 위한 줄기세포치료제의 규제기관에서 인정가능한 생체외 종양 형성능 시험법을 확립하여, 연구개발자에게 표준 시험법을 제시하기 위하여 줄기세포치료제 모델로 이용되고 있는 인간 신경줄기세포인 HB1.F3 세포와 이들 세포에 종양유발 Ras 유전자가 전이된 HB1.F3-Ras 세포를 이용하여 줄기세포치료제의 종양형성에 대한 안전성을 in vitro와 in vivo 세포형질전환 시험 및 소프트 아가 콜로니 형성 시험을 통해 분석하여 안전성 평가 시험법을 확립하였다.
첫째, HB1.F3 세포와 HB1.F3-R

본 연구과제에서는 임상적용을 위한 줄기세포치료제의 규제기관에서 인정가능한 생체외 종양 형성능 시험법을 확립하여, 연구개발자에게 표준 시험법을 제시하기 위하여 줄기세포치료제 모델로 이용되고 있는 인간 신경줄기세포인 HB1.F3 세포와 이들 세포에 종양유발 Ras 유전자가 전이된 HB1.F3-Ras 세포를 이용하여 줄기세포치료제의 종양형성에 대한 안전성을 in vitro와 in vivo 세포형질전환 시험 및 소프트 아가 콜로니 형성 시험을 통해 분석하여 안전성 평가 시험법을 확립하였다.
첫째, HB1.F3 세포와 HB1.F3-Ras 세포를 이용한 in vitro와 in vivo 세포형질전환 시험으로서 종양관련 유전자의 발현 양상을 비교하고, nude mouse를 이용하여 생체내에서의 종양 형성능을 비교 분석한 결과, HB1.F3-Ras 세포와 비교해서 HB1.F3 세포에서 종양특이적 유전자 발현은 증가되지 않았으며, 세포 배양상에서 세포형태가 pile-up되는 것이 확인되지 않았으나, 200만개의 세포가 nude mouse에 주입된 결과 주입 후 97일 부터 종양 형성이 확인되었다. 따라서 이러한 결과는 일부 종양형성능을 가진 HB1.F3세포가 정상적인 HB1.F3 세포에 포함되어 있거나, in vivo nude mouse에 주입될 경우 일부 세포가 종양능을 획득할 수 있다는 두 가지 가능성을 제시한다.
둘째, HB1.F3 세포와 HB1.F3-Ras 세포를 이용하여 수행한 소프트 아가 콜로니 배양 방법으로 세포수, 배양기간 및 배양조건에 따른 콜로니 형성 시험 결과, 200만개의 HB1F3 세포가 소프트 아가 콜로니 배양 조건에서 배양될 경우 종양세포의 특성 중에 하나인 anchorage-independent한 foci를 형성하는 것을 확인하였으며, foci 수는 HB1.F3-Ras 세포에 비교해서 현저하게 적은 것으로 판단했을 때 HB1.F3 세포내 일부 세포가 종양형성능을 가지고 있는 것으로 판단된다. 결론적으로 정상적인 줄기세포 치료제로 판단되는 세포일지라도 이들 세포 내 일부 세포는 종양형성능을 가진 세포가 포함되어 있을 가능성을 제시하였으며, 임상적용을 위한 줄기세포치료제의 경우 다양한 시험방법으로 이들 치료제의 종양형성에 대한 안전성을 확인해야 될 것으로 판단된다.
위의 결과를 바탕으로 줄기세포치료제의 종양 형성 가능성에 대한 평가를 세포형질전환 및 소프트 아가 콜로니 형성 시험을 통해 분석하여 임상적용을 위한 줄기세포치료제의 종양발생에 대한 in vitro 안전성 평가 시험법 확립 및 과학적 근거 자료 제시할 수 있다.

Abstract ▼

In the current research project, we conducted a number of in vitro and in vivo cell transformation and soft agar colony formation assays using normal human neural stem cell, HB1.F3, to establish standard operation procedure for clinical use of stem cell-based therapeutics.
First, HB1.F3 cells sho

In the current research project, we conducted a number of in vitro and in vivo cell transformation and soft agar colony formation assays using normal human neural stem cell, HB1.F3, to establish standard operation procedure for clinical use of stem cell-based therapeutics.
First, HB1.F3 cells showed that expression of the various oncogenic genes was not increased as compared to those of oncogenic Ras-transduced HB1.F3 (HB1.F3-Ras) cells. Furthermore, in contrast to HB1.F3-Ras cells, HB1.F3 cells did not show density-independent growth pattern in vitro culture. However, as $2{\times}106$ HB1.F3 cells were subcutaneously injected into nude mouse, these cells are able to produce tumors, although tumor size and latency of these cells are significantly smaller and slower than those of HB1.F3-Ras cells. These results suggest two possibilities that original HB1.F3 cells might contain a number of tumorigenic cells or a number of HB1.F3 cells might convert to tumorlgenic cells nude mouse in vivo.
Second, in the soft agar colony formation assay, a number of HB1.F3 cells are able to form anchorage-independent foci, whereas foci number and size generated from HB1.F3 cells were remarkabley less and smaller than those of HB1.F3-Ras cells. This result suggests that a number of tumorigenic cells might be contained into original HB1.F3 cells.
Therefore, prior to consideration a clinical use of stem cell-based therapeutics, tumorigenesis of stem cells should be carefully monitored and validated following standard operation procedure which is established by current research.

목차 Contents

• 표지...1
• 용역연구사업 연구결과보고서...2
• 제출문...5
• 목차...6
• I . 연구개발결과 요약문...7
• 연구결과보고서 요약문...7
• Summary...9
• II. 총괄연구개발과제 연구결과...11
• 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...11
• 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법...13
• 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과...16
• 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...32
• 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과...33
• 제6장 기타 중요변경사항...34
• 제7장 참고문헌...34
• 제8장 첨부서류...34