보고서 정보
주관연구기관 |
조선대학교 Chosun University |
연구책임자 |
정혜광
|
참여연구자 |
한은희
,
최재호
,
박혜진
,
권태금
,
황용필
,
김형균
,
황수진
,
서경빈
|
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2007-11 |
과제시작연도 |
2007 |
주관부처 |
식품의약품안전청 |
사업 관리 기관 |
식품의약품안전청 Korea Food & Drug Administration |
등록번호 |
TRKO200800006271 |
과제고유번호 |
1475003260 |
사업명 |
안전성관리기반연구 |
DB 구축일자 |
2013-04-18
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키워드 |
면역독성기작.면역계 독성물질.면역독성.염증유발 유전자.Immune toxicological mechanism.toxic compounds.immune toxic compound.immune toxicity.cyclooxygenase.
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초록
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o 본 연구과제는 면역 이상 과잉 반응에 의한 면역독성으로 알러지 및 염증 반응 관련 in vitro 면역 독성 평가방법을 통해 국민 건강에 심각한 영향을 미치는 면역계 독성물질의 독성 작용기작을 규명하고 독성물질을 스크리닝할 수 있는 기반 기술을 확립함으로서 독성물질의 국가 관리 기반 구축에 기여할 수 있는 면역계 독성물질의 독성 작용영향을 연구하고자 하였음.
o 본 연구에서는 즉시형 과민반응을 일으킬 가능성이 있는 면역독성물질의 면역독성을 평가하기 위하여 대표적으로 알러지를 유발한다고 알려진 subtilisin 외에 본 연
o 본 연구과제는 면역 이상 과잉 반응에 의한 면역독성으로 알러지 및 염증 반응 관련 in vitro 면역 독성 평가방법을 통해 국민 건강에 심각한 영향을 미치는 면역계 독성물질의 독성 작용기작을 규명하고 독성물질을 스크리닝할 수 있는 기반 기술을 확립함으로서 독성물질의 국가 관리 기반 구축에 기여할 수 있는 면역계 독성물질의 독성 작용영향을 연구하고자 하였음.
o 본 연구에서는 즉시형 과민반응을 일으킬 가능성이 있는 면역독성물질의 면역독성을 평가하기 위하여 대표적으로 알러지를 유발한다고 알려진 subtilisin 외에 본 연구과제에서 확립된 시험법을 평가하기 위한 시험물질로 식품 및 화장품의 첨가제인 butylated-hydroxytoluene (BHT)와 미국에서 새로 개발되어 잉크 등의 원료로 사용되는 azo dye (yellow, red) 및 식품에 잔류할 수 있는 농약 성분인 o,p'-DDT 등을 시험물질로 선정하여 알러지에 미치는 영향을 일차 비장세포와 비만세포주의 공동 배양을 수행하여 확인하고, 과민성 면역반응에 의해 생성된 IgE로 인한 비만세포의 탈 과립 방출량, histamine 생성량, 면역반응의 대표적인 cytokine인 IL-4와 IL-5의 생성 및 발현, IL-4 유전자의 발현에 중요한 역할을 하는 전사조절인자의 역할을 규명하여 독성물질의 알러지에 대한 작용기전을 연구하고자 하였음.
o 비만세포의 탈 과립 방출량, histamine, IL-4와 IL-5, IgE의 생성에 대한 영향을 측정하기 위하여 일차 비장세포와 비만세포를 공동배양하고 시험물질인 pollen, ovalbumin (OVA), subtilisin, BHT, azo dye (yellow, red)와 o,p'-DDT를 처리한 결과, pollen, OVA, subtilisin, o,p'-DDT에 의해 비만세포의 탈과립과 histamine 방출량, IL-4와 IL-5, IgE 생성량이 증가하였으나 BHT, azo dye (yellow, red)는 아무런 영향이 없었음. 또한 양성 대조군인 ionomycin을 동시 처리한 경우 pollen, OVA, subtilisin, o,p'-DDT, BHT에서 비만세포의 탈과립과 histamine 방출량, IL-4와 IL-5, IgE 생성량이 증가하여 BHT는 알러젠과 동시에 노출되었을 경우에만 알러지 반응이 유발되는 것으로 사료되며 azo dye (yellow, red)는 아무런 영향이 없었음.
o 비만세포주에 DNP-IgE로 감작을 시켜 비만세포의 탈 과립 방출량, histamine, IL-4와 IL-5, IgE의 생성에 대한 영향을 측정한 결과, subtilisin, o,p'-DDT에 의해 비만세포의 탈과립과 histamine 방출량, IL-4와 IL-5, IgE 생성량, IL-4와 IL-5의 유전자 발현이 증가하였으나 BHT, azo dye (yellow, red)는 아무런 영향이 없었음. DNP-IgE로 감작시킨 후 항원인 DNP-BSA를 동시 처리하였을 경우 subtilisin, BHT, o,p'-DDT에서 비만세포의 탈과립과 위의 인자들이 증가하여 BHT는 알러젠과 동시에 노출되었을 경우에만 알러지 반응이 유발되는 것으로 사료되며 azo dye (yellow, red)는 아무런 영향이 없었음. Real time PCR을 이용하여 RT-PCR 결과를 재확인하였음.
o Subtilisin의 경우 비만세포주에 DNP-IgE로 감작시키지 않고 단독 처리할 경우에도 알러지 반응을 유발시켜 기존의 IgE에 의해 매개되는 알러지 관련 면역독성 외에 protease activated receptor (PAR)에 대한 신호전달과정에 대해 관련성을 조사한 결과, PAR-4에 특이적으로 subtilisin이 알러지 유발에 관여함을 확인하였음. 또한 PAR-1, 2, 3, 4에 특이적인 primer를 제작하여 유전자 발현을 확인한 결과 subtilisin 자체가 PAR-2, 4의 발현을 증가시켰음.
o IL-4와 IL-4의 전사활성에 관여하는 NF-AT 전사조절인자에 대한n, OVA, subtilisin, BHT, azo dye (yellow, red)와 o,p'-DDT를 처리한 결과 subtilisin과 o,p'-DDT에 의해 이들의 전사활성이 증가하였으며, DNP-IgE로 감작시킨 후 항원인 DNP-BSA와 동시 처리하였을 경우에는 subtilisin BHT o,p'-DDT에서 IL-4와 NF-AT의 전사활성이 증가하였음.
o IL-4의 promoter의 deletion promoter ($-270{\sim}55,\;-235{\sim}+55,\;-95{\sim}+55$와 $-65{\sim}+55$)를 제작하고 비만세포에 형질전환시킨 다음 IL-4 promoter의 활성을 측정한 결과, subtilisin과 o,p'-DDT가 $-270\sim+55$와 $-235\sim+55$ promoter에서 전사활성이 증가하였음. 또한 BHT는 DNP-BSA와 동시처리 하였을 경우에 한하여 $-270\sim+55$ promoter의 전사활성이 증가하였음.
o 비만세포주에 IL-4-luciferase를 일시적인 형질전환시키지 않고 IL-4-luciferase 유전자가 영구적으로 발현되도록 하기위하여 IL-4 luciferase promoter 형질전환 비만세포주를 확립하였음. 이를 이용하여 pollen, OVA, subtilisin, BHT, azo dye (yellow, red)와 o,p'-DDT를 처리하여 IL-4의 전사활성에 대한 영향을 측정한 결과, subtilisin, o,p'-DDT에 의해 IL-4의 전사활성이 증가하였으며, DNP-IgE로 감작시킨 후 항원인 DNP-BSA와 동시처리에서는 subtilisin, BHT, o,p'-DDT에서 IL-4의 전사활성이 증가하였음.
o 알러지 반응을 유발시키는 물질들에 의한 상위 신호전달체계를 조사하기 위하여 subtilisin과 o,p'-DDT에 의한 MAPKs의 변화를 확인한 결과, subtilisin, o,p'-DDT의 알러지성 면역독성 유발시 관여하는 상위 신호전달 체계는 ERK과 p38, JNK의 MAPKs 모든 신호체계가 관여하며, BHT는 p38과 JNK임을 확인하였음.
o Subtilisin, BHT, azo dye 및 o,p'-DDT의 염증 관련 면역독성을 평가하기 위하여 이들 물질의 염증에 미치는 영향을 염증매개 인자인 NO, PGE2, 염증성 cytokine의 생성 및 COX-2 유전자에 대한 연구를 수행하고, 이들의 발현과 직접적인 관련이 있는 전사 조절인자의 활성 측정 및 상위 신호전달체계를 규명하여 독성물질의 염증에 대한 작용기전을 연구하고자 하였음.
o 염증매개 인자인 NO, PGE2, 염증성 cytokine의 생성 및 COX-2 유전자에 대한 영향을 조사하기 위하여 대식세포에 subtilisin, BHT, azo dye (yellow, red)와 o,p'-DDT를 처리한 결과 subtilisin, o,p'-DDT에 의해 NO의 생성량이 증가하였으며, subtilisin, o,p'-DDT, azo dye (red)에 의해 $PGE_2$ 생성량과 COX-2 유전자 발현 단백질 발현 및 염증관련 사이토카인인 TNF-$\alpha$, IL-6, IL-1$\beta$의 생성량이 증가하였음.
o COX-2 발현에 관여하는 전사조절인자를 확인하기 위하여 COX-2 promoter와 COX-2의 전사조절에 관여하는 주요전사인자인 NF-${\kappa}B$, AP-1, CRE, C/EBP luciferase vector를 대식세포에 형질전환 시킨 다음, subtilisin, BHT, azo dye (yellow, red)와 o,p'-DDT를 처리한 결과 subtilisin, o,p'-DDT, azo dye (red)가 농도 의존적으로 COX-2의 전사활성이 증가시켰으며, subtilisin은 AP-1, o,p'-DDT는 CRE와 AP-1의 전사조절인자에 의해 COX-2 전사활성이 조절됨을 확인하였음.
o 염증 반응을 유발시키는 물질들의 상위 신호전달체계를 확인하기 위하여 subtilisin과 o,p'-DDT에 의한 MAPKs의 변화를 확인한 결과 ERK과 p38, JNK의 MAPKs 모든 신호체계가 관여함을 확인하였음. BHT는 p38, JNK의 신호체계가 관여함을 확인하였음.
o 본 연구를 통해 알러지 및 염증유발과 같은 면역계 독성을 유발시킬 수 있을 것으로 예상되는 subtilisin, o,p'-DDT, BHT, azo dye (yellow, red)를 이용하여 in vitro 면역독성 유발에 대한 영향을 스크리닝 함으로써 알러지 및 염증 반응 관련 in vitro 면역독성 평가방법을 확립하였으며, 국민건강에 심각한 영향을 미치는 면역계 독성물질의 독성 작용기작을 규명하고 독성물질을 스크리닝할 수 있는 기반 기술을 확립함으로서 독성물질의 국가 관리 기반 구축에 기여할 수 있을 것으로 기대됨.
Abstract
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This study was focused on the development of molecular biological methods for evaluating the immune toxicity of immune toxicity compounds, such as subtilsin, o.p'-DDT, BHT, azo dye (yellow, red) on the immune related IL-4 and IL-5 production and inflammatory related COX-2 expression. We investigate
This study was focused on the development of molecular biological methods for evaluating the immune toxicity of immune toxicity compounds, such as subtilsin, o.p'-DDT, BHT, azo dye (yellow, red) on the immune related IL-4 and IL-5 production and inflammatory related COX-2 expression. We investigate the effect of $\beta$-hexosaminidase activity, histamine release, IL-4 and IL-5 production and IgE production of subtilsin, o.p'-DDT, BHT, azo dye (yellow, red), pollen and OVA in splenocytes and mast cells. Ionomycin, subtilsin, o.p'-DDT, pollen and OVA induced $\beta$-hexosaminidase activity, histamine release, IL-4 and IL-5 production, IgE production in splenocytes and mast cells. Also, BHT treated with ionomycin induced $\beta$-hexosaminidase activity, histamine release, IL-4 and IL-S production, IgE production in splenocytes and mast cells. In addition to, we investigate the effect of $\beta$-hexosaminidase activity, histamine release, IL-4 and IL-5 production and IgE production of subtilsin, o.p'-DDT, BHT, azo dye (yellow, red), pollen and OVA in mast RBL-2H3 cells. DNP-BSA, subtilsin and o.p'-DDT induced $\beta$-hexosaminidase activity, histamine release, IL-4 and IL-5 production, IgE production in mast cells. Also, BHT treated with DNP-BSA induced $\beta$-hexosaminidase activity, histamine release, IL-4 and IL-5 production, IgE production in splenocytes and mast cells. Subtilin, serine protease, induced $\beta$-hexosaminidase activity and IL-4 gene expression mediated protease activated receptor (PAR)-4. The transactivity of IL-4 and NF-AT after the treatment of subtilsin and o.p'-DDT were enhanced in dose-dependent manner by the results of transient transfection experiment in mast cells. Also, BHT treated with DNP-BSA induced IL-4 and NF-AT transactivity in mast cells. Moreover, we settelmented IL-4 stable mast cell line and then we investigated the effect of IL-4 transactivity of subtilsin, o.p'-DDT, BHT, azo dye (yellow, red). Subtilsin and o.p'-DDT induced IL-4 transactivlty in IL-4 stable mast cell line. MAPKS, including ERK, p38 and JNK, are the most improtein kinases that mediate the post-translational modification of the IL-4 proteins. Furthermore, subtilisin and o,p'-DDT enhances the phosphorylation of all 3 MAPKS in mast cells. Also, we investigate the COX-2 gene expression level and NO and PGE2 producton of subtilsin, o.p'-DDT, BHT and azo dye (yellow, red) in macrophage Raw 264.7 cells. Subtilsin, o.p'-DDT induced NO, PGE2 producton and COX-2 gene expression. The transactivity of COX-2 after the treatment of subtilsin, o.p'-DDT, BHT and azo dye (yellow, red) were enhanced in dose-dependent manner by the results of transient transfection experiment in Raw 264.7 cells. Also, the transcriptional regulation of COX-2 might be regulated by NF-${\kappa}B$ and AP-1 by the results of transient transfection experiment using deletion constructs of COX-2 promoter. The transcriptional factor binding activity of AP-1 were induced after the treatment of subtilisin in Raw 264.7 cells. Western blotting analysis showed that subtilisin and o,p'-DDT induced activation of MAPK (ERK, p38 and JNK). Quantitative analysis for immunotoxicity of immune toxic compounds could be possible from the assessment of in vitro experiments by subtilsin, o.p'-DDT, BHT and azo dye (yellow, red) caused immune and inflammatory toxicity.
목차 Contents
- 용역연구사업 연구결과보고서...1
- 표지...2
- 제출문...3
- 목차...5
- I. 연구개발결과 요약문...6
- 연구결과보고서 요약문...6
- Summary...9
- II. 총괄연구개발과제 연구결과...11
- 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...11
- 1.1 총괄연구개발과제의 목표...11
- 1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도...16
- 1.3 국내.외 기술개발 현황...17
- 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법...19
- 2.1. 연구내용...19
- 2.2. 연구방법...25
- 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과...29
- 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...71
- 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과...77
- 5.1 활용성과...77
- 5.2 활용계획...78
- 제6장 기타 중요 변경사항...79
- 제7장 참고문헌...81
- 제8장 첨부서류...84
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