초록 ▼

본 연구에서는 첫째, phage display법을 사용하여 양식 어류의 다양한 병원체에 대한 단클론항체를 신속하게 제조하는 기술을 개발하고, 둘째, 양식 어류의 다양한 병원체에 대한 단클론항체를 사용하여 다양한 병원체를 동시에 진단하는 고효율 진단 기술을 개발하며, 셋째, 다양한 바이러스의 면역유도단백질 및 중화 epitope를 지니는 단백질들을 신속하고 고효율로 분석하는 기술을 개발하는 것을 목표로 하였다. 이와 같은 목표를 달성하기 위하여 수행한 연구 내용은 다음과 같다.
1. Mouse 항첼 유전자를 대상으로 phage

본 연구에서는 첫째, phage display법을 사용하여 양식 어류의 다양한 병원체에 대한 단클론항체를 신속하게 제조하는 기술을 개발하고, 둘째, 양식 어류의 다양한 병원체에 대한 단클론항체를 사용하여 다양한 병원체를 동시에 진단하는 고효율 진단 기술을 개발하며, 셋째, 다양한 바이러스의 면역유도단백질 및 중화 epitope를 지니는 단백질들을 신속하고 고효율로 분석하는 기술을 개발하는 것을 목표로 하였다. 이와 같은 목표를 달성하기 위하여 수행한 연구 내용은 다음과 같다.
1. Mouse 항첼 유전자를 대상으로 phage display library 제조
o 20 마리의 Balb/c mouse로 부터 spleen cell을 분리하여 이들을 섞은 후 mRNA를 추출 하였고 이로부터 cDNA를 합성
o Mouse의 모든 VH gene segment의 leader sequence를 포함하는 degenerated PCR primer (mouse VH back primers)와 mouse의 4개 JH gene segment 각각에 대한 4개의 PCR primer (mouse JH forward primers)를 사용하여 mouse heavy chain의 V region을 증폭
o Light chain의 경우 kappa (k)와 lambda $(\lambda)$ 중 repertoire가 많은 kappa chain만을 대상으로 PCR 증폭을 시도. Mouse의 모든 VK gene segment를 포함하는 degenerated PCR primer (mouse VK back primers)와 mouse의 5개 JK gene segment 각각에 대한 5개의 PCR primer (mouse ft forward primers)를 사용하여 mouse light chain의 V region을 증폭.
o 증폭된 VH와 VK gene fragment를 linker $[(Gly_4-ser)_3]$를 사용하여 VH-linker-VK의 형태로 연결하여 single chain Fv (scFv) gene으로 연결. 이와 같이 연결된 scFv gene을 template로 하고 VH back SfiI primer와 JK forward NotI primer를 사용하여 PCR을 수행한 다음 이를 pCANTAB 5E phagemid vector의 SfiI/NotI site에 cloning.
o scFV/pCANTAB 5E phagemid vector를 사용하여 E. coli TG1 strain을 transformation 시키고 여기에 M13 KO7 helper phage를 첨가하여 phage rescue를 시킴으로써 phage display library를 제조
2. 제조한 phage display library의 size 및 유의성 검증
o E. coli TG1 strain을 사용한 plaque assay를 통하여 library size 분석하여 $10^{10}PFU/ml$ 이상임을 확인.
o 양식 돌돔에서 분리된 E. tarda와 iridovirus를 항원으로 하여 scFv phage display library로부터 scFv 단클론항체를 제조. 이때 E. tarda 항원은 formalin으로 처리하여 죽인 항원을 사용하였으며 iridovirus는 major capsid protein (MCP) 유전자를 E. coli에서 발현시킨 재조합단백질을 항원으로 사용. 이들 항원을 대상으로 약 13일 만에 scFv 단클론항체가 제조됨을 확인.
o 원하는 scFv 항체를 display하고 있는 M13 phage를 E. coli HB2151 strain에 infection 시켜 soluble form의 scFv를 분리하였으며 이 항체를 사용하여 ELISA, Western blotting, 중화실험, immunohistochemistry등에 적용 가능한지를 확인.
3. 기존에 보고된 넙치의 세균성 병원체들에 대한 scFv 단클론항체 제조
o 기존에 보고된 세균 수집: Vibrio vulnificus, Streptococcus iniae, Edwardsiella tarda, Photobacterium damselae
o 세균들의 배양 및 scFv screening을 위한 항원 준비 완료
o 세균들에 대한 scFv 단클론항체 제조 완료
o ELISA, western blotting, immunohistochemistry에 적합한 항체 선별
4. 기존에 보고된 넙치의 바이러스성 병원체들에 대한 scFv 단클론항체 제조
o 기존에 보고된 바이러스 수집: Lymphocystis virus, marine birnavirus, Hirame rhabdovirus, nodavirus, VHSV, iridovirus
o scFv screening을 위한 바이러스들의 항원 준비 완료
재조합단백질: marine birnavirus, nodavirus, iridovirus
peptide 합성: lymphocystis virus, hirame rhabdovirus, VHSV
o 바이러스들에 대한 scFv 단클론항체 제조 완료
o ELISA western blotting, immunohistochemistry, 중화실험 에 적합한 항체 선별
5. 국내외에서 새로 발견되는 병원체들에 대하여 scFv 단클론항체 제조
o 다음과 같은 병원체에 대한 항원 준비 완료
외국에서 넙치에 감염하는 것으로 밝혀진 IPNV: VP2 및 VP3 재조합단백질 준비 완료
우리나라에서 양식되는 넙치와 유사한 flounder에 감염하는 것으로 밝혀진 SFRV: peptide 합성 완료
o scFv 항체 제조 완료
o ELISA, western blotting, immunohistochemistry에 적합한 항체 선별
6. 제조한 scFv 단클론 항체를 사용하여 기존에 보고된 세균 및 바이러스들을 동시에 신속 진단하는 기술 개발
o 지금까지 보고 된 넙치의 병원성 세균 및 바이러스들을 동시에 screening할 수 있는 ELISA system 개발
o 넙치 양식장에서 사육 중 질병에 걸린 넙치들을 대상으로 ELISA 키트 현장 적용 실험
o 지금까지 보고 된 넙치의 병원성 세균 및 바이러스들을 동시에 screening할 수 있는 ELISPOT 진단키트 개발
o 넙치 양식장에서 사육 중 질병에 걸린 넙치들을 대상으로 ELISPOT 키트 현장 적용실험
7. 적조한 scFv 단클론 항체를 사용하여 기존에 보고된 넙치 바이러스의 면역유도단백질 및 중화 epitope를 지니는 단백질 확인
o 지금까지 보고 된 넙치의 바이러스들에 대하여 면역유도단백질과 중화 epitope의 분석 및 확인
o 선별된 바이러스들의 단백질들을 대장균에서 발현시킨 후 넙치에 주사하여 실제 면역반응을 유발하는 지, 그리고 중화 항체를 유도하는 지 확인

Abstract ▼

This research project focuses on (1) the development of technique to produce monoclonal antibodies against flounder pathogens using phage-displayed scFv library, (2) the development of rapid screening kit for flounder pathogens using monoclonal antibodies and (3) the development of technique to dete

This research project focuses on (1) the development of technique to produce monoclonal antibodies against flounder pathogens using phage-displayed scFv library, (2) the development of rapid screening kit for flounder pathogens using monoclonal antibodies and (3) the development of technique to determine immunogenic protein neutralizing epitope-containing protein among viral structural proteins using monoclonal antibodies.
1. Preparation of phage displayed scFv library from mouse immunoglobulin genes
o Extraction of mRNA from spleen cells of 20 mice and cDNA synthesis.
o Preparation of degenerated PCR primer containing all leader sequences of mouse VH gene segment (mouse VH back primers) and 4 mouse JH forward primers. Amplification of mouse heavy chain V region genes using these PCR primers.
o Preparation of degenerated PCR primer containing all sequences of mouse VK gene segment (mouse VK back primers) and 5 mouse JK forward primers. Amplification of mouse light chain V region genes using these PCR primers.
o Preparation of single chain Fv (scFv) genes (VH-linker-VK) by linkine VH and VK gene fragment using linker $[(Gly_4-ser)_3]$. PCR amplification of these scFv genes using VH back SfiI primer and ft forward NotI primer. Subcloning of the PCR products into SfiI/NotI site of pCANTAB 5E phagemid vectore.
o Transformation of E. coli TG1 strain with scFv/pCANTAB 5E phagemid vector in the presence of M13 KO7 helper phage and preparation of phage displayed scFv library.
2. Confirmation of the titer of phage displayed scFv library
o Confirmation of phage displayed scFv library: more than $10^{10}PFU/ml$.
o Confirmation whether this library can be used to produce monoclonal antibodies against flounder pathgens, E. tarda and iridovirus (recombinant protein of MCP), within 20days: Production of scFv monoclonal antibodies against these pathogens in 13 days.
o Production of soluble scFv monoclonal antibodies by infection of M13 phage into E. coli HB2151 strain. Determination of the availability of these scFv to ELISA, Western blotting, neutralization, and immunohistochemistry.
3. Production of scFv monoclonal antibodies against bacterial pathogens of flounder
o Collection of bacterial pathogens of flounder: Vibrio vulnificus, Streptococcus iniae, Edwardsiella tarda, Photobacterium damselae
o Antigen preparation for screening of scFv monoclonal antibodies
o Selection and production of scFv monoclonal antibodies against bacterial pathogens
o Determination of the availability of these scFv to ELISA, Western blotting, neutralization, and immunohistochemistry.
4. Production of scFv monoclonal antibodies against viral pathogens of flounder
o Collection of viruses infecting flounder: Lymphocystis virus, marine birnavirus, Hirame rhabdovirus, nodavirus, VHSV, iridovirus
o Antigen preparation for screening of scFv monoclonal antibodies:
- Recombinant protein: marine bimavirus, nodavirus, iridovirus
- Peptide synthesis: lymphocystis virus, hirame rhabdovirus, VHSV
o Selection and production of scFv monoclonal antibodies against viruses
o Determination of the availability of these scFv to ELISA, Western blotting, neutralization, and immunohistochemistry.
5. Production of scFv monoclonal antibodies against new pathogens of flounder
o Preparation of antigens
- IPNV: recombinant protein of VP2 and VP3
- SFRV: peptide synthesis from amino acid seuence of L protein
o Selection and production of scFv monoclonal antibodies against these antigens
o Determination of the availability of these scFv to ELISA, Western blotting, neutralization, and immunohistochemistry.
6. Development of rapid screening technique to detect bacterial and viral pathogens of flounder using scFv monoclonal antibodies
o Development of ELISA system for rapid screening of bacterial and viral pathogens of flounder
o Application of this ELISA system to diseased flounder
o Development of ELISPOT system for rapid screening of bacterial and viral pathogens of flounder
o Application of this ELISPOT system to diseased flounder
7. Determination of immunogenic and neutralizing epitope-containing protein using scFv monoclonal antibodies
o Application of scFv monoclonal antibodies to determine immunogenic proteins and neutralizing epitope-containing proteins among viral structural proteins.
o Determination whether the selected viral protein can induce neutralizing antibodies in flounder.

목차 Contents

• 제 1 장 연구개발과재의 개요...27
  • 제 1 절 기술적 측면....27
    • 
      제 2 절 경제.산업적 측면....31
    • 
      제 3 절 사회.문화적 측면....32
    제 2 장 국내외 기술개발 현황...34
  • 제 1 절 국외 관련 기술의 현황 및 문제점....34
    • 
      제 2 절 국내의 관련 기술 현황 및 문제점....36
    • 
      제 3 절 앞으로의 전망....38
    제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과...40
  • 제 1 절 연구수행 방법....40
    • 1. 항체 유전자의 phage display library 제조....40
      • 
        2. 제조한 phage display library의 size 분석....40
      • 
        3. 제조한 phage display library의 유의성 검증....41
      • 
        4. 기존에 보고된 넙치 병원성 세균들에 대한 scFv 단클론항체 제조....41
      • 
        5. 기존에 보고된 넙치 바이러스에 대한 scFv 단클론항체 제조....42
      • 
        6. 국내외에서 새로이 보고되는 병원체에 대한 scFv 단클론항체 제조....42
      • 
        7. ELISA를 사용한 신속진단기술 개발....43
      • 
        8. ELISPOT를 사용한 신속진단 기술 개발....44
      • 
        9. 바이러스의 면역유도 단백질 및 중화 epitope 분석....44
      제 2 절 연구수행 내용....45
    • 1. Mouse 항체 유전자를 대상으로 phage display library 제조....45
      • 
        2. 제조한 phage display library의 size 및 유의성 검증....45
      • 
        3. 기존에 보고된 넙치의 세균성 병원체들에 대한 scFv 단클론항체 제조....46
      • 
        4. 기존에 보고된 넙치의 바이러스성 병원체들에 대한 scFv 단클론항체 제조....46
      • 
        5. 국내외에서 새로 발견되는 병원체들에 대하여 scFv 단클론항체 제조....46
      • 
        6. 제조한 scFv 단클론항체를 사용하여 기존에 보고된 세균 및 바이러스들을 동시에 신속진단하는 기술 개발....46
      • 
        7. 제조한 scFv 단클론항체를 사용하여 기존에 보고된 넙치 바이러스의 면역유도단백질 및 중화 epitope를 지니는 단백질 확인....47
      제 3 절 연구 결과....48
    • 1. Mouse 항체 유전자를 대상으로 phage display libra 제조....48
      • 
        2. 제조한 phage display library의 size 및 유의성 검증....54
      • 
        3. 기존에 보고된 넙치의 세균성 병원체들에 대한 scFv 단클론항체 제조....59
      • 
        4. 기존에 보고된 넙치의 바이러스성 병원체들에 대한 scFv 단클론항체 제조....61
      • 
        5. 국내외에서 새로 발견되는 병원체들에 대하여 scFv 단클론항체 제조....67
      • 
        6. 제조한 scFv 단클론항체를 사용하여 기존에 보고된 세균 및 바이러스들을 동시에 신속진단하는 기술 개발....70
      • 
        7. 제조한 scFv 단클론항체를 사용하여 기존에 보고된 넙치 바이러스의 면역유도단백질 및 중화 epitope를 지니는 단백질 확인....75
    제 4 장 연구개발 목표달성도 및 관련분야에의 기여도...79
  • 제 1 절 연구개발 목표 및 평가의 착안점....79
    • 1. 연구개발 목표....79
      • 
        2. 연차별 연구개발 목표와 내용....80
      • 
        3. 평가의 착안점....81
      제 2 절 연구개발 목표의 달성도....81
    • 1. Mouse 항체 유전자를 대상으로 phage display library 제조....81
      • 
        2. 제조한 phage display library의 size 및 유의성 검증....82
      • 
        3. 기존에 보고된 넙치의 세균성 병원체들에 대한 scFv 단클론항체 제조....82
      • 
        4. 기존에 보고된 넙치의 바이러스성 병원체들에 대한 scFv 단클론항체 제조....82
      • 
        5. 국내외에서하여 기존에 보고된 세균 및 바이러스들을 동시에 신속진단하는 기술 개발....83
      • 
        7. 제조한 scFv 단클론항체를 사용하여 기존에 보고된 넙치 바이러스의 면역유도단백질 및 중화 epitope를 지니는 단백질 확인....83
      제 3 절 상기 평가의 착안점에 따른 달성도에 대한 자체평가....84
    제 5 장 연구개발결과의 활용계획...85
  • 제 1 절 현장보급 방안....85
    • 
      제 2 절 산업화 계획 방안....85
    • 
      제 3 절 추가기술 개발 방안....85
    • 
      제 4 절 기술이전 방안....85
    제 6 장 참고문헌...87