초록 ▼

바이오촉매를 이용한 에너지 저감형 신에스테르화 반응공정 및 IT용 기능성 아크릴 고분자중간체 개발을 위하여 먼저 자연계로부터 큐티나아제 효소 유전자를 클로닝하고, 재조합 대장균 발현시스템을 이용하여 바이오촉매효소의 대량 발현, 생산 및 정제 분리 시스템 개발하였음. 이때 불활성형으로 발현되는 바이오촉매효소의 활성형 고효율 생산을 위해 비교 단백질체학 기술을 이용한 대장균으로부터 다양한 스트레스 유발 조건하에서 융합파트너 단백질을 선별하여 불활성 바이오촉매 효소 단백질과 융합발현을 시도함. 이를 통해 높은 효소활성을 띠고 있는 재조합

바이오촉매를 이용한 에너지 저감형 신에스테르화 반응공정 및 IT용 기능성 아크릴 고분자중간체 개발을 위하여 먼저 자연계로부터 큐티나아제 효소 유전자를 클로닝하고, 재조합 대장균 발현시스템을 이용하여 바이오촉매효소의 대량 발현, 생산 및 정제 분리 시스템 개발하였음. 이때 불활성형으로 발현되는 바이오촉매효소의 활성형 고효율 생산을 위해 비교 단백질체학 기술을 이용한 대장균으로부터 다양한 스트레스 유발 조건하에서 융합파트너 단백질을 선별하여 불활성 바이오촉매 효소 단백질과 융합발현을 시도함. 이를 통해 높은 효소활성을 띠고 있는 재조합 생촉매 단백질을 효과적으로 확보 할 수 있었음. 한편 바이오촉매효소 고정화용 담체 설계 및 PMMA 계열의 담체 합성, 큐티 나아제를 이용한 저분자 폴리아크릴레이트 대상 반응 및 transesterification 합성 조건 최적화연구를 수행함으로서 바이오 촉매를 이용한 에너지 저감형 신에스테르화 반응공정 개발에 있어 기반 기술을 확립함.

Abstract ▼

We newly proposed the BT-ET-IT hybrid technology for development of recombinant biocatalyst and applied process for environmentally-friendly production of electronic polymer intermediates. Recently, although the bicatalytic processes by specific enzymes has been significantly considered as one of th

We newly proposed the BT-ET-IT hybrid technology for development of recombinant biocatalyst and applied process for environmentally-friendly production of electronic polymer intermediates. Recently, although the bicatalytic processes by specific enzymes has been significantly considered as one of the great industrially potential technologies for next generations, our national efforts have not been enough in defining what is means, in developing what it can do, and in raising people who understand and execute the tasks in the field. This report is a reflection of our national efforts as follow.
1. Gene cloning and direct expression of Pseudomonas putida cutinase
The application of cutinase, which is a known hydrolytic enzyme that degrades cutin and has potential roles in the biotechnological applications, is very promising as new biological enzymes. We acquired cutinase gene from Pseudomonas putida and demonstrated the development of high efficiency expression system of Escherichia coli. PCR amplifications were performed and the sequences of cutinase genes were confirmed. For the expression and purification of cutinase, the recombinant genes were inserted into plasmid pET28a, and E. coli strain BL21(DE3) was transformed with the plasmid expression vectors. When the culture turbidity ($OD_{600nm}$) reached 0.5, gene expression was induced with the addition of IPTG (1mM). After a further 3-4 h of cultivation at 37℃, the recombinant cells were harvested. As shown in Fig. 3, the recombinant cutinase aggregated and formed inclusion bodies when expressed directly, and solubility's were almost negligible.

목차 Contents

• [붙임] 최종보고서(초안) 제출 요령...1
• 표지...4
• 제출문...5
• 보고서 초록...6
• 요약문...7
• SUMMARY...11
• CONTENTS...16
• 목차...17
• 그림 목차...18
• 표 목차...19
• 제1장 연구개발과제의 개요...20
• 1. 연구개발대상 기술의 경제적.산업적 중요성 및 연구개발의 필요성...20
• (가) 연구개발 대상의 기술적 측면의 중요성 및 필요성...22
• (나) 연구개발 대상의 경제적.산업적 측면의 중요성 및 필요성...23
• (다) 연구개발 대상의 사회, 문화, 환경적 측면의 중요성 및 필요성...25
• 제2장 국내외 기술 개발 현황...28
• 1. 국외 기술 개발 현황...28
• 2. 국내 기술 개발 현황...31
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과...38
• 1. Cutinase 유전자 클로닝 및 단독 발현...38
• 2. 융합 단백질 발굴을 위한 2-DE 분석...39
• 3. 융합 발현된 재조합 cutinase의 효소 활성 확인...41
• 4. Cutinase 생산 균주 선별을 위한 배양 및 큐틴 분해능 평가...44
• 5. Candida antarctica lipase B 유전자 클로닝 및 단독 발현...47
• 6. 융합 단백질 발굴을 위한 2-DE analysis...49
• 7. 융합 발현된 Candida antarctica lipase B의 효소 활성 확인...50
• 8. 신규 균주 Pseudozyma jejuensis sp. nov.의 분류 및 신종등록...53
• 9. Bacillus subtilis 유래의 p-nitrobenzyl esterase 발굴 및 esterification 효능 검증...57
• 10. Macroporous 담체 합성...59
• 11. Cutinase의 담체 고정화...62
• 12. 저분자 폴리아크릴레이트에 아크릴기 도입 반응...63
• 13. 반응조건에 따른 저분자 폴리아크릴레이트에 아크릴기 도입 반응 양상...64
• 제4장 목표 달성도 및 관련분야에의 기여도...69
• 제5장 연구개발결과의 활용계획...71
• 1. 기술적 측변의 연구개발결과 활용 계획...71
• 2. 환경적 측변의 연구개발결과 활용 계획...71
• 3. 경제적.산업적 측면의 연구개발결과 활용 계획...72
• 4. 학문적 측면의 연구개발결과 활용 계획...72
• 5. 국내.외 시장규모...73
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술 정보...76
• 1. 국외 연구현황 및 연구개발 성과의 활용 현황...76
• 2. 국내 연구현황 및 연구개발 성과의 활용 현황...77
• 제7장 결론...80
• 1. 바이오촉매효소 탐색시스템 개발 및 신규 화학반응용 바이오촉매...80
• 2. 바이오 촉매를 이용한 에너지 저감형 신에스테르화 반응공정 개발을 위한 기반기술확립...81
• 제8장 참고문헌...83
• (첨부) 연구성과 활용계획서...86