초록 ▼

연구목표
고추에서 역병저항성을 유발하는 phytoalexin인 capsidiol의 생합성을 촉매하는 Cyt P450 효소 중 5-epi-aristolochene hydroxylase 유전자를 cloning하여 역병저항성의 분자생물학적 기작을 밝히고, 고추로부터 역병균에 의해서 특이적으로 발현되는 유전자를 탐색함으로서 역병저항성 고추의 개발을 위한 유전자 소스를 확보하기 위함
연구내용
고추 식물체 및 배양세포에 병원균과 이미 알려진 몇몇의 elicitor를 처리하여 세포의 생리적 반응, 스트레스에 의해서 생성된 phy

연구목표
고추에서 역병저항성을 유발하는 phytoalexin인 capsidiol의 생합성을 촉매하는 Cyt P450 효소 중 5-epi-aristolochene hydroxylase 유전자를 cloning하여 역병저항성의 분자생물학적 기작을 밝히고, 고추로부터 역병균에 의해서 특이적으로 발현되는 유전자를 탐색함으로서 역병저항성 고추의 개발을 위한 유전자 소스를 확보하기 위함
연구내용
고추 식물체 및 배양세포에 병원균과 이미 알려진 몇몇의 elicitor를 처리하여 세포의 생리적 반응, 스트레스에 의해서 생성된 phytoalexin의 동정, 관련효소의 활성측정, 유전자(cDNA)의 cloning과 sequencing, 유전자의 발현특성 및 형질전환체 육성 순으로 실시하였다. 실험은 ‘① Phytoalexin의 생산 요인 구명 및 물질의 탐색 ②유도성효소의 동정 및 활성 검정 ③ 세포배양에 의한 phytoalexine의 생산 기작 연구 ④ Cyt P450 유전자군을 cloning하기 위한 cDNA screening ⑤ 유전자의 발현특성 구명 및 염기서열 구명 ⑦ 형질전환체 육성연구’ 등을 수행하였다.
연구성과
① 고추 식물체 및 배양세포에서 capsidiol의 생합성을 인위적으로 조절할 수 있는 elicitor 즉 cellulase, jasmonic acid, arachidonic acid 등을 밝혔음
② 고추 배양세포에서 elicitor에 의해서만 발현되는 12개의 Cyt P450 유전자를 찾아냈으며, 그 중 강한 특이성을 보인 P450K01 및 P450K02의 full-sequence를 cloning함.
③ Clone된 유전자의 염기서열 분석결과 담배의 5-EAS-1,3-dihydroxylase에 관여하는 유전자군과 95-98%까지 homology가 있었고, 다수의 식물 Cyt P450 유전자군과 homology가 있었으나, 본 연구에서 clone된 유전자는 Data base 조사결과 동일한 염기서열을 가진 유전자는 없는 새로운 유전자임
④ Clone된 유전자의 발현정도가 세포의 capsidiol 생합성 능력과 일치하여, 이 유전자가 capsidiol의 생합성 유전자 5-EAS-1,3-dihydroxylase 임을 밝혔고, P450 억제제의 반응으로 고추의 5-EAS hydroxylase가 Cyt P450 유전자임을 증명함
⑤유전자의 형질전환 및 genome, promoter에 관한 연구가 계속 수행중임

Abstract ▼

Purpose of Research
5-EAS hydroxylase as P450 enzyme family catalyzes the conversion of 5-EAS to capsidiol. Capsidiol is a principal phytoalexin found in tobacco and pepper tissues challenged by Phytopthera pathogene or fungal elicitors. Despite of prevalency and physiological importance, relativ

Purpose of Research
5-EAS hydroxylase as P450 enzyme family catalyzes the conversion of 5-EAS to capsidiol. Capsidiol is a principal phytoalexin found in tobacco and pepper tissues challenged by Phytopthera pathogene or fungal elicitors. Despite of prevalency and physiological importance, relatively little is know about the number of P450 enzymes in plant tissues and their expression pattern. The objectives of this study is focused on ① the cloning and characterization of P450 gene(s) which is specifically expressed by Phytopthera pathogen ② elucidation of molecular mechanism of disease resistance in pepper ③ Obtaining gene sources for the development of Phytopthera resistant transgenic plant.
Contents of Research
① Determination of various conditions for pepper cell elicitation for the production of capsidiol: elicitation of plant leaf, fruit and cultured cell by VU stress and various elicitors, cellulase, jasmonic acid, arachidonic acid and Phytopthera infection. ② Cloning of cytochrome P450 genes: mRNA preparation and RT-PCR by P450 specific primer, cDNA screening for full sequence gene, nucleotide sequence analysis, nother hybridization for gene expression, Data base analysis and gene comparison. ③ Molecular mechanism of isoterpenoid biosynthesis: feeding of [H3]-5-EAS to culture cell and measured capsidiol concentration, effect of P450 inhibitors, ancymidol and ketocornazole, on P450 enzyme activity. ④ Vector construction and transformation: Agrobacterium-mediated transgenic plant, GUS, PCR, antibiotic selection of transgenic plants. GUS expression of EAS-promoter.
Effectiveness of Research
.① Twelve elicitor-inducible Cyt P450 cDNAs were identified and full sequenced P450K1 and P450K2 which showed high specificity to elicitation ② In homology check based on nucleotide and amino acid sequence, cloned cDNAs, P450K1 and -K2 showed more than 95% identity with tobacco EAS-1,3-dihydroxyase. suggesting these clones encoding Cyt P450 enzyme responsible for the production of capsidiol ③ Enzymes involved in the serial pathway of capsidiol biosynthesis, FPP→ 5-EAS→ capsidiol, from cytosol and microsomal fraction of elicited cell were identified in pepper cells ④ P450 inhibitors, ancymidol and ketoconazole, significantly inhibited the production of capsidiol, suggesting that P450 enzyme is involved in the pathway of capsidiol production ⑤ Levels of P450K01 expression were highly correlated with the levels of extracellular capsidiol production by different elicitors in cell cultures. P450K01 transcript was also induced by several other elicitors such as, cellulase, arachidonic acid, jasmonic acid, Phytopthera infection as well as UV stress.

목차 Contents

• Ⅰ. 연구계획 요약문 ...3
• 1. 국문요약문 ...3
• Ⅱ. 연구결과 요약문 ...4
• 1. 국문요약문 ...4
• 2. 영문요약문 ...5
• Ⅲ. 연구내용 ...6
• 1. 서론 ...6
• 2. 연구방법 및 이론 ...7
• 3. 결과 및 고찰 ...8
• 4. 결론 ...19
• 5. 인용문헌 ...20