초록 ▼

혈관형성인자들 중 가장 강력하다고 알려진 vascular endothelial growth factor (VEGF) 는 암세포 혹은 숙주세포에서 분비되어 내피세포를 자극, 혈관 투과성을 증가시키고 여러 조직에서 혈관형성능을 나타낸다고 알려져 있다. 따라서 VEGF의 발현, 생산 기작을 파악하는 것은 암의 증식 및 전이를 차단하는 중요한 조건으로 생각된다. 본 연구의 목표는 혈소판활성인자 (platelet-activating factor, PAF)에 의한 암증식 및 혈관형성에 있어서 NF-HB의 역할, PAF에 의한 VEGF 발현에

혈관형성인자들 중 가장 강력하다고 알려진 vascular endothelial growth factor (VEGF) 는 암세포 혹은 숙주세포에서 분비되어 내피세포를 자극, 혈관 투과성을 증가시키고 여러 조직에서 혈관형성능을 나타낸다고 알려져 있다. 따라서 VEGF의 발현, 생산 기작을 파악하는 것은 암의 증식 및 전이를 차단하는 중요한 조건으로 생각된다. 본 연구의 목표는 혈소판활성인자 (platelet-activating factor, PAF)에 의한 암증식 및 혈관형성에 있어서 NF-HB의 역할, PAF에 의한 VEGF 발현에 있어서 p53과 NF-${\kappa}B$의 상호작용, 여러 가지 전사인자와 cofactor의 상호조절 기작 연구를 통하여 암의 전이 및 혈관형성에 필수적인 VEGF 발현의 분자적 조절기작 규명으로 다음과 같은 결과를 얻었다.
PAF에 의한 암증식 및 혈관형성에 있어서 NF-${\kappa}B$의 역할: PAF에 의한 B16F10 흑색종의 apoptosis를 조절하는 인자들의 영향을 실험한 결과 PAF에 의해 Bcl-2나 Bcl-xL과 같은 anti apoptotic factor들의 mRAN 발현 및 단백질 합성은 증가되나, Bax와 같은 proapoptotic factor의 발현은 증가되지 않았다. 이러한 PAF의 효과는 NF-${\kappa}B$ 선택적인 저해제, parthenolide에 의해 차단되었으며 더욱이, PAF은 etoposide에 의해 유도된 caspase-3, 8, 9 활성 및 세포 죽음을 억제하였다. p50/p65 heterodimer는 Bcl-2, Bcl-xL의 mRNA 발현을 증가시켰으며 etoposide에 의해 유도된 caspase 활성 및 세포죽음을 감소시켰다. Matrigel을 이용한 in vivo 실험모델에서, PAF은 B16F10 흑색종의 증식을 촉진하였으며 etoposide에 의해 유도된 흑색종의 증식 억제를 완와하였다. 이러한 결과는 PAF이 흑색종에서 NF-${\kappa}B$ 의존적으로 antiapoptotic factors의 발현을 up-regulation 함으로써 화학요법제에 의한 cytotoxic effect를 감소시킴을 시사하였다 (Cancer Research 2006; 66: 4681-4686).
PAF에 의한 VEGF 발현에 있어서 NF-${\kappa}B$의 p53의 상호작용: ECV304세포에 NF-${\kappa}B$ subunits을 transfection 하였을 때 TNF-$\alpha$ promoter 활성이 증가되었으며, 이는 p53에 의해 완전히 억제되었다. 또한 p53으로 transfection 하였을 때 증가된 p53RE promoter 활성은 NF-${\kappa}B$ subunits에 의해 완전히 억제되었는데 이는 NF-${\kappa}B$와 p53사이에 cross-regulation이 존재함을 시사한다. PAF에 의해 증가된 VEGF 발현은 p53 활성 감소와 관련되어있다. 이러한 결과로 NF-${\kappa}B$ 의존적인 PAF-induced VEGF 발현증가는 NF-${\kappa}B$ 활성증가에 의해 조절되는 p53 활성 감소에 의한 것임을 시사한다 (FEBS Letters 2006; 580: 3006-3012).
PAF에 의한 VEGF 발현에 있어서 여러 가지 전사인자들과 cofactors의 상호작용 : H1299 세포에 PAF을 처리하였을 때 VEGF 전사활성과 mRNA 발현이 증가되었고, NF-${\kappa}B$, activator protein (AP)-1, stimulating protein (Sp)1 전사인자가 활성화 되었다. NF-${\kappa}B$, AP-1 및 p53은 PAF에 의한 VEGF 발현 조절에 관여? 않았다. Promoter delection assay를 통하여 PAF에 의한 VEGF 발현에 -1286/-790이 중요하게 작용함을 알 수 있었고, NF-${\kappa}B$, AP-1 또한 PAF과 동일한 부위에서 작용함을 알 수 있었다. 면역침강법으로 PAF이 p65/c-Jun 혹은 p65/c-Fos 복합체를 증가시킴을 확인하였는데, 이는 NF-${\kappa}B$가 AP-1과의 결합을 통하여 AP-1에 의해 유도되는 VEGF 발현을 증가시킴을 시사한다 또한, p53은 VEGF promoter의 -414/+50에 작용하여 VEGF 발현을 억제하였다. 실험결과를 종합하면, NF-${\kappa}B$는 AP-1과의 결합을 통하여 VEGF 발현을 조절함을 알 수 있었다. NF-${\kappa}B$와 p53 상호 조절에 의한 VEGF 발현에 p300/CBP의 관련성은 p65/50 NF-${\kappa}B$ subunit에 의해 증가된 promoter 활성이 p300/CBP에 의해 억제되었으며 p53과 p300/CBP에 의해 억제된 활성이 p65/50에 의해 회복되지 않았다.

Abstract ▼

The most potent angiogenic factor, vascular endothelial growth factor (VEGF), being released from tumor cells as host cells, Increase vascular permeability and angiogenesis in various organs through stimulating vascular endothelial cells. Therefore, the understanding of mechanisms for VEGF expressio

The most potent angiogenic factor, vascular endothelial growth factor (VEGF), being released from tumor cells as host cells, Increase vascular permeability and angiogenesis in various organs through stimulating vascular endothelial cells. Therefore, the understanding of mechanisms for VEGF expression and production is important in tumor biology. The purpose of the present study was to investigate molecular mechanism for platelet-activating factor (PAF)-induced increase in VEGF expression. This study was designed to establish a new strategy for tumor therapy by delineating molecular regulating mechanism of VEGF expression through investigation the role of nuclear factor (NF)-${\kappa}B$, the interaction between p53 and NF-${\kappa}B$ and the interactions between various transcriptional factors and cofactors in PAF-induced enhancement in tumor growth and anglogenesis.
We investigated the influence of PAF on the induction of apoptosis regulating factors in B16F10 melanoma cells. PAF increased the expression of mRNA and the protein synthesis of antiapoptotic factors, such as Bcl-2 and Bcl-xL, but did not increase the expression of the proapoptotic factor, Bax. A selective NF-${\kappa}B$ inhibitor, parthenolide, inhibited the effects of PAF, Furthermore, PAF inhibited etoposide-induced increases in caspase-3, caspase-8, and caspase-9 activities, as well as cell death. p50/p65 heterodimer increased the mRNA expression of Bcl-2 and Bcl-xL and decreased etoposide-induced caspase activities and cell death. In an in vivo model in which Matrigel was injected s.c., PAF augmented the growth of B16F10 cells and attenuated etoposide-induced inhibition of B16F10 cells growth. These data indicate that PAF induces up-regulation of antiapoptotic factors in a NF-${\kappa}B$-dependent manner in a melanoma cell line, therefore suggesting that PAF may diminish the cytotoxic effect of chemotherapeutic agents (Cancer Research 2006; 66: 4681-4686).
We investigated the role of p53 in NF-${\kappa}B$ dependent, PAF-induced VEGF expression. Transfected NF-${\kappa}B$ subunits in ECV304 cells increased the tumor necrosis factor-$\alpha$ promoter activity, which was completely inhibited by p53. Transfected p53 increased p53RE promoter activity, which was completely inhibited by NF-${\kappa}B$ subunits, indicating that cross-regulation occurs between NF-${\kappa}B$ and p53. PAF induced increase in VEGF expression was correlated with decreased p53 activity. These data suggest that NF-${\kappa}B$-dependency of the PAF-induced increase in VEGF expression is due to decreased p53 activity, which is reciprocally regulated by increased NF-${\kappa}B$ activity (FEBS Letters 2006; 580: 3006-3012).
PAF enhanced trascriptional activation and mRNA expression of VEGF. PAF induced various transcription factors, such as NF-${\kappa}B$, activation protein (AP)-1, and stimulation protein (Sp)1 in H1299 cells. NF-${\kappa}B$, AP-1 and p53 were involvede in the regulation of PAF-induced VEGF expression. Sp1 enhanced VEGF expression but Spl inhibitor, mithramycin, did not inhibit PAF-induced increase in VEGF expression. Promoter deletion assay demonstrated that -1286/-790 region within VEGF promoter was critical for PAF-induced increase in VEGF expression. Additionally this region was found to be critical for NF-${\kappa}B$ or AP-1-mediated increase in VEGF expression. Immunoprecipitation revealed that PAF induced the formation of complexes of p65/c-Jun and p65/c-Fos, suggesting that NF-${\kappa}B$ enhanced VEGF expression through AP-1-mediated increase in VEGF expression. Promoter deletion assay also demonstrated that -414/+50 region of VEGF promoter was found to be responsible for p53-induced inhibition of VEGF expression. Collectively, these results suggest that NF-${\kappa}B$ and p53 regulate VEGF expression through interaction with AP-1 but not Sp-1.

목차 Contents

• 표지...1
• 제출문...2
• 목차...3
• I. 연구개발결과과 요약문...4
• 연구개발사업 최종보고서 요약문...4
• Project Summery...6
• II. 연구개발과제 연구결과...8
• 1. 연구개발과제의 최종 연구개발 목표...8
• 2. 연구개발과제의 연구대상 및 방법...11
• 3. 연구개발과제의 연구개발결과...13
• 4. 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...20
• 5. 연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...23
• 6. 연구개발과제의 활용계획...25
• 7. 참고문헌...26
• 8. 첨부서류...31