초록 ▼

1) HIF binding sequence (HRE)가 도입된 promoter 구축과 이 vector에 도입된 유전자 (t-PA)의 발현정도 확인 - HRE가 도입된 세포주를 semi- anaerobic high density suspension adapted-cell에서 그 생산능은 약 3.7배 증가 2) Small scale의 bioreactor에서 유도되는 저산소증 조건에서의 단백질 생산성 확인 - t-PA 발현시에 저산소증에서 유도되는 전사조절인자인 HIF가 promoter의 HRE에 결합할 수 있도록 구축된 세포주는 대조군

1) HIF binding sequence (HRE)가 도입된 promoter 구축과 이 vector에 도입된 유전자 (t-PA)의 발현정도 확인 - HRE가 도입된 세포주를 semi- anaerobic high density suspension adapted-cell에서 그 생산능은 약 3.7배 증가 2) Small scale의 bioreactor에서 유도되는 저산소증 조건에서의 단백질 생산성 확인 - t-PA 발현시에 저산소증에서 유도되는 전사조절인자인 HIF가 promoter의 HRE에 결합할 수 있도록 구축된 세포주는 대조군 세포주에 비해서 약 7배의 생산성이 증가 3) pH와 oxidative damage에 안정화된 우량세포주에 저산소증에서 유도될 수 있는 유전자의 도입 후 그 생산성 확인 4) 단백질 분리 정제와 저 단가의 생산을 위하여 소량 혹은 무혈청 배지에서 적응된 세포주 개발 5) 부착성 세포주에서 부유성 세포로의 적응 - Spinner flask 상에서 무혈청 배지를 이용하여 우량세포주를 부유성 세포주로 적응 - 고농도 대량 부유성 세포주로 적응시키고자 bead culture 수행 6) t-PA 이외의 EPO를 비롯한 다양한 고단가 단백질의 생산성 확인 - 무혈청 배지하에서 우량 세포주를 부유성으로 적응시킨 후 EPO의 생산성 확인 (대조군과 비교하여 10배 이상 증가) 7) 고농도 생산성 확인 - 무혈청 배지하에서 우량 세포주를 대량 suspension 배양 (150 ml) 시에 EPO의 생산성이 대조군과 비교하였을 때 10배 이상 증가됨을 확인 8) 세포내 산성화에 따른 세포 사멸 기전 규명 9) 대사 경로가 각기 다른 세포주를 통하여 산화적 스트레스로 인한 세포 사멸기전을 규명 10) 세포사멸 억제 단백질인 bcl-2 유전자의 도입과 유용 단백질이 생산성 증가

Abstract ▼

Chinese hamster ovary (CHO) cells are an useful mammalian expression host that have been extensively employed for the production of therapeutic recombinant glycoproteins. These cells are easily genetically manipulated and proteins produced in these cells have a similar glycans to those of human, tha

Chinese hamster ovary (CHO) cells are an useful mammalian expression host that have been extensively employed for the production of therapeutic recombinant glycoproteins. These cells are easily genetically manipulated and proteins produced in these cells have a similar glycans to those of human, that is critical in vivo biological activity.

목차 Contents

• 제 1 장 연구개발과제의 개요...12
• 1. 연구개발의 목적...12
• 2. 연구개발의 필요성...12
• 가. 기술적 측면...12
• 나. 경제.산업적 측면...13
• 다. 사회.문화적 측면...13
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황...14
• 1. 외국의 경우...14
• 2. 국내의 경우...14
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과...15
• 제 1 절 연구개발수행 내용...15
• 1. 추진전략...15
• 2. 추진방법...15
• 가. 1차년도 : 저산소증에서 단백질발현이 유도되는 promoter 개발과 생산성 확인...15
• (1) 세포배양과 세포 내로의 유전자 도입...15
• (2) Lactate dehydrogenase (LDH) 활성 측정...16
• (3) 세포질에 존재하는 Glycerol 3-phosphate dehydrogenase (cGPDH) 활성 측정...16
• (4) $CO_{2}$가 공급되지 않는 조건에서의 세포배양시의 배양액 pH와 lactate 양 변화 측정...16
• (5) tPA Assay...16
• 나. 2차년도 : pH와 oxidative damage에 안정화된 세포주에 저산소증에서 유도될 수 있는 유전자의 도입...17
• (1) 저산소증 (Hypoxia)으로 CHO dhfr-에서 HIF 유도여부의 확인 ; Nuclear extracts 준비와 Electrophoretic mobility shift assay(EMSA)...17
• (2) 저산소증 의존성 세포주 개발...17
• 다. 3차년도 : 다양한 carbon source를 이용한 고효율 생산 세포주 개발과 Roller bottle에 의한 고농도 생산...18
• (1) EPO assay...18
• (2) 무혈청 배지에서 부유성 세포로의 적응...18
• 제 2절 연구개잘수행 결과...19
• 1. 장기 배양시 세포내와 배지의 pH가 안정한 세포주 개발...19
• 2. Oxidative damage에 안정한 세포주 개발...19
• 3. 저 산소 조건에서 유전자 발현을 유도할 수 있는 promoter 제작과 이를 이용한 t-PA의 생산...24
• 4. Semi-anaerobic high density suspension adapted-cell에서 t-PA의 생성...24
• 5. pH의 안정화오 저산소 조건에서도 과량 발현이 가능한 벡터 구축...30
• 6. 우량 세포주의 장기 배양을 통한 EPO의 과량 생산...30
• 7. 저 산소 조건하에서 우량 세포주에 도입된 EPO의 과량 생산...30
• 8. 무혈청 배지에서 고농도 대량 부유성 우량세포주의 EPO 생산...29
• 9. 생산 EPO의 glycosylation 양상 확인...31
• 10. 세포내 산성화에 따른 apoptosis...38
• 11. 세포내 산성화에 따른 미토콘드리아의 손상...38
• 12. 세포내 활성화에 따른 세포사멸 신호전달체계 규명...38
• 13. 대사경로에 따른 전자 전달계의 활성 조절...41
• 14. 대사경로에 따른 미토콘드리아의 활성화 산소종의 생성 조절...41
• 15. 대사경로의 변형에 따른 oxidative damage에 대한 저항성과 세포 사멸 양상의 변화...41
• 16. 미토콘드리아로 유입되는 환원력 양에 따른 미토콘드리아 팽창의 조절...41
• 17. 세포사멸 억제 단백질인 bcl-2 유전자의 도입과 유용 단백질이 생산성 증가...47
• 18. 저산소증시에 유도되는 세포 사멸을 bcl-2 유전자 도입을 통해 억제...47
• 19. bcl-2 유전자 도입을 통해 저산소증시 t-PA 생산의 증가...47
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도...51
• 1. 계획대비 달성도...51
• 2. 연차별 연구개발목표 및 연구개발비용...51
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획...54
• 1. 기술적 효과...54
• 2. 경제적 효과...54
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보...55
• 1. 선진국에서 단백질 의약품 산업의 전망...55
• 2. 미토콘드리아에 의한 세포 사멸 기전...55
• 3. 활성화 산소종과 노화와의 관계...56
• 제 7 장 참고문헌...57