초록 ▼

C형 간염을 일으키는 C형 간염 바이러스의 증식을 억제하기 위한 후보물질을 찾는다. 특이적 작용점은 C형 간염 바이러스의 NS5B polymerase로 하며, 이의 활성을 억제하는 펩타이드와 scFv를 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선별하여 그 억제효과를 측정한다. 정제된 HCV NS5B polymerase를 대상으로 여기에 강력히 binding하는 peptide를 상업적으로 판매되는 파지디스플레이 라이브러리로부터 선별한다. 또한 HCV의 translation에 반드시 필요한 IRES를 가지는 5‘ UTR의 RNA를 대상으로 같은

C형 간염을 일으키는 C형 간염 바이러스의 증식을 억제하기 위한 후보물질을 찾는다. 특이적 작용점은 C형 간염 바이러스의 NS5B polymerase로 하며, 이의 활성을 억제하는 펩타이드와 scFv를 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선별하여 그 억제효과를 측정한다. 정제된 HCV NS5B polymerase를 대상으로 여기에 강력히 binding하는 peptide를 상업적으로 판매되는 파지디스플레이 라이브러리로부터 선별한다. 또한 HCV의 translation에 반드시 필요한 IRES를 가지는 5‘ UTR의 RNA를 대상으로 같은 라이브러리로부터 강력히 binding하는 펩타이드를 선별한다. 쥐를 정제된 NS5B로 immunize한 후에 그 spleen으로부터 mRNA를 얻고 RT-PCR을 통하여 파지디스플레이 scFv 라이브러리를 제작한다. 제작한 라이브러리로부터 HCV NS5B에 강력히 binding하는 scFv를 선별한다. 선별된 펩타이드와 scFv가 실제 HCV NS5B의 효소활성을 저해하는지를 test tube와 cell-based assay system을 이용하여 측정한다. 정제된 NS5B polymerase에 강하게 binding하는 펩타이드를 12mer 라이브러리로부터 3종, 7mer 라이브러리로부터 4종을 선별할수 있었다. 이들을 phage ELISA를 수행한 결과 dose-dependent하게 target에 binding하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 HCV의 5‘ UTR에 binding하는 펩타이드를 수종 선별하여 그중 하나인 12mer의 서열을 확인하였고, 현재 다른 후보들의 서열을 확인 중이다. NS5B에 binding하는 7종의 펩타이드중에 가장 많이 selection된 3종을 펩타이드로 합성하여 그 저해 효과를 측정하였다. 실험은 Covalink module에서 정제된 NS5B polymerase와 3’UTR RNA를 이용하여 이루어 졌는데, 3종 모두 nM range의 저해효과를 나타내는 것이 관찰되었다. 한 편, svFv의 라이브러리는 매우 여러번의 시행착오를 거치며 조합 PCR을 통하여 제작되었다. 만들어진 라이브러리에서 NS5B에 강하게 binding하는 후보들을 선별하여 현재 그 염기 서열을 조사중이다. 앞에서 얻어진 펩타이드들은 cell based assay에서 그 효과를 측정하기 위하여 GST에 fusion된 형태로 intracellular expresion을 위한 consturct를 제작 중이며, scFv도 intracellular expression을 위한 construct 제작에 들어갈 단계에 있다. 전반적으로 의도했던 선별작업과 라이브러리 제작 작업이 성공적으로 마쳐졌으며, 그 저해효과가 일부 확인되었고, 나머지 확인을 위한 작업이 곧 마쳐질 것으로 기대된다.

Abstract ▼

The purpose of this research is to screen inhibitors of hepatitis C virus. Specifically, the target is NS5B polymerase of HCV, and inhibitory peptides and scFvs are screened from phage display library. Commercially available peptide libraries are screened for binding to purified NS5B polymerase. The

The purpose of this research is to screen inhibitors of hepatitis C virus. Specifically, the target is NS5B polymerase of HCV, and inhibitory peptides and scFvs are screened from phage display library. Commercially available peptide libraries are screened for binding to purified NS5B polymerase. The same phage display libraries are searched for binding to 5'UTR of HCV which contains IRES essential for translation. After immunizing mouses with purified NS5B polymerase, spleens are recoverd and total RNAs are isolated, then phage display scFv libraries are constructed using RT-PCR. This library is screened for binding to HCV NS5B polymerase. The inhibitory effect of selected peptides and scFvs are determined both in test tube assay system and in cell based assay system for HCV NS5B polymerase. 3 peptides from 12mer library and 4 peptides from 7mer library were selected by biopanning. A phage ELISA result showed these peptides bound to the target protein in a dose-dependent manner. The same libraries were screened for binding to HCV 5' UTR, and several peptides were selected and the amino acid sequences are currently under investigation. Among 7 peptides selected for binding to NS5B, 3 were chosen and synthesized as peptides to check the inhibitory effects. The assay was done using purified NS5B polymerase and 3' UTR RNA in Covalink module, and all 3 showed to inhibit the enzymatic activity of NS5B to nM range. The scFv library was constructed after many trial and errors using combinatorial RT-PCR. The library was screned for binding to NS5B and sequences of selected scFvs are currently under investigation. Peptides and scFv are made for intracellular expression constructs for assay in cell based system. The construction and screening of libraries were successful and the candidates were partially confirmed for their inhibitory effect and currently under investigation for remaining confirmation.

목차 Contents

• I. 연구계획 요약문...3
• 1. 국문요약문...3
• II. 연구결과 요약문...4
• 1. 국문요약문...4
• 2. 영문요약문...5
• III. 연구내용...6
• 1. 서론...6
• 2. 연구방법 및 이론...8
• 3. 결과 및 고찰...11
• 4. 결론...18
• 5. 인용문헌...19