연구계획: Acetolactate synthase (ALS)는 박테리아, 효모, 그리고 고등식물에서 아미노산 Val, Leu, Ile의 생합성에 공통적으로 관여하는 효소이다. 또한 ALS는 최근에 개발된 sulfonylureas, imidazolinones, triazolopyrimidines 그리고 개발이 진행중인 몇 가지 제초제들의 작용 표적으로 밝혀졌다. ALS는 식물에서 함량이 매우 낮고, 동물에는 존재하지 않으므로, ALS 표적 제초제는 제초력이 탁월하며 동물에 대한 독성이 매우 낮다. ALS는 다양한 구조의 화합물에 의해
연구계획: Acetolactate synthase (ALS)는 박테리아, 효모, 그리고 고등식물에서 아미노산 Val, Leu, Ile의 생합성에 공통적으로 관여하는 효소이다. 또한 ALS는 최근에 개발된 sulfonylureas, imidazolinones, triazolopyrimidines 그리고 개발이 진행중인 몇 가지 제초제들의 작용 표적으로 밝혀졌다. ALS는 식물에서 함량이 매우 낮고, 동물에는 존재하지 않으므로, ALS 표적 제초제는 제초력이 탁월하며 동물에 대한 독성이 매우 낮다. ALS는 다양한 구조의 화합물에 의해 그 활성이 저해되므로, 신 제초제 개발 가능성은 높다. ALS를 표적으로 하는 새로운 제초제 개발과 제초제 내성 작물의 개발을 위해 ALS에 대한 보다 심도 있는 생화학적, 유전공학적 연구가 요청된다. 본 연구에서는 담배 ALS 유전자를 대장균에서 대량으로 발현시켜 ALS 효소를 정제한다. 정제한 ALS를 이용하여 토끼로부터 항체를 제조하며, 정제한 항체를 이용하여, 식물로부터 ALS를 정제하여 식물 ALS의 특성 및 구조에 관한 연구를 수행한다. 담배 ALS 유전자에 대한 site-directed mutagenesis와 발현을 통해 mutant ALS를 얻어 효소학적 특성을 조사하며, 흡광, 형광, CD등 분자분광학적 연구와 제초제에 대한 저항성 등을 조사하여 활성자리와 제초제 결합부위의 아미노산 잔기의 구성과 서열을 결정한다. 담배 ALS의 구조와 기능, 연구로부터 촉매메카니즘을 규명하고 새로운 제초제를 설계하는데 필요한 정보를 얻을 것이다. 제초제 결합에 관여하는 아미노산 잔기가 확인되면, 다양한 mutation을 수행하여, 제초제에 저항성을 가지면서 wild-type 효소와 유사한 효소학적 성질을 갖는 ALS 변이 유전자를 선별하여 식물의 형질 변환을 수행하여 제초제 내성작물을 개발한다. 또한 기존에 알려진 제초제 내성 Arabidopsis 및 담배 ALS 유전자를 다른 작물 (감자, 벼)의 형질 변환에 이용한다. 연구결과: 본 연구에서는 담배 ALS 유전자를 대장균에서 대량으로 발현시켜 ALS 효소를 정제하였다. 정제한 ALS를 이용하여 토끼로부터 재조한 항체를 이용하여 담배로 부터 ALS를 정제하였다. 담배 ALS 유전자에 대한 site-directed mutagenesis와 deletion mutatioin을 통해 mutant ALS 유전자를 얻었다. Mutant ALS 유전자를 대장균에서 대량으로 발현시켜 효소를 정제하여 효소학적 특성을 조사하고, 흡광, 형광, CD 등 분광학적 연구를 수행하여 활성자리의 기능 아미노산 잔기를 규명하였다. 또한 mutant ALS의 제초제에 의한 저해를 측정하여 제초제 결합에 관여하는 아미노산 잔기를 조사하였다. 제초제에 내성을 가지면서 효소활성을 갖는 K577F와 W573F 변이 유전자를 이용하여 담배와 감자의 형질변환을 수행하였다. 재조합 담배 ALS에 대한 여러 가지 반응속도론적 연구를 수행하여 kinetic mechanism을 조사하고 catalytic 기능을 하는 아미노산 잔기의 pKa를 구하였다.
Abstract▼
In this study, we expressed tobacco ALS gene in E. coli and purified the enzyme. Anti-ALS antibody was prepared from rabbit using purified recombinant tobacco ALS. And ALS enzyme was purified from tobacco using affinity chromatography of ALS antibody. ALS mutant gene were prepared by site-directed m
In this study, we expressed tobacco ALS gene in E. coli and purified the enzyme. Anti-ALS antibody was prepared from rabbit using purified recombinant tobacco ALS. And ALS enzyme was purified from tobacco using affinity chromatography of ALS antibody. ALS mutant gene were prepared by site-directed mutagenesis and deletion mutation of tobacco ALS gene. And we expressed the mutant genes in E. coli and purified the enzymes. We elucidated the active site amino acid residues by determining the enzymatic properties, the spectra of absorption, emission, and CD of mutant enzymes. We determined the amino acid residues involved in the binding of herbicides by measuing the inhibition of the mutant enzymes by herbicides. We constructed transgenic tobacco and potato using K255F and W573F ALS mutant genes of tobacco. We determined the kinetic mechanism of ALS reaction and pKa values of amino acid residues with catalytic function.
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