초록 ▼

토양 세균인 Burkholderia sp. YK-2와 Pseudomonas sp. HK-6에서 농약 2,4-D, 2,4,5-T, atrazine, 그리고 simazine에 대한 세포반응과 유도 단백질체의 분석을 연구하였다. 먼저 농약 2,4-D와 2,4,5-T에 대해서 스트레스 반응으로 유도된 균주 YK-2의 세포반응에 대하여 조사하였다. 43-kDa DnaK와 와 41-kDa GroEL 단백질이 2,4-D와 2,4,5-T의 아치사 농도에 노출된 YK-2세포에서 각각 합성되었다. 균주 YK-2는 2,4,5-T의 독성효과가 2,4-D

토양 세균인 Burkholderia sp. YK-2와 Pseudomonas sp. HK-6에서 농약 2,4-D, 2,4,5-T, atrazine, 그리고 simazine에 대한 세포반응과 유도 단백질체의 분석을 연구하였다. 먼저 농약 2,4-D와 2,4,5-T에 대해서 스트레스 반응으로 유도된 균주 YK-2의 세포반응에 대하여 조사하였다. 43-kDa DnaK와 와 41-kDa GroEL 단백질이 2,4-D와 2,4,5-T의 아치사 농도에 노출된 YK-2세포에서 각각 합성되었다. 균주 YK-2는 2,4,5-T의 독성효과가 2,4-D에서 보다 더욱 크다는 것을 암시하는 반응이 나타났으며 생리적 및 형태적 변화에서 볼 때 2,4-D에서 보다 2,4,5-T에서 더 민감한 반응을 나타내었다. 2,4-D나 2,4,5-T에 처리된 세포 세포의 표면이 쭈그러지고 구멍이 뚫려있는 것이 주사전자현미경 분석을 통하여 관찰되었다. 이들 불규칙성은 2,4-D로 처리된 세포에서보다 2,4,5-T에 처리된 세포에서 더욱 빈번히 발견되었다. 지방산 분석은 2,4-D와 2,4,5-T에 대한 총 세초 지방산 조성의 전환에서 유사한 효과를 보여주었다. 균주 YK-2는 2.25 mM의 2,4-D가 대사되는 동안 대사물질로서 2,4-dichlorophenol의 일시적으로 생성되었으며 28시간의 배양기간동안 완전히 분해되었다. 그러나 2,4,5-T는 분해되지 않았다. Biolog와 16S rDNA는 YK-2가 Burkholderia cepacia 종과 98%의 유사성을 가지고 있음을 보여주었으며 따라서이 균주를 B. cepacia YK-2로 명명하였다. 현저히 유도된 3개의 충격단백질 #1, #2, #3는 각각 30-kDa, 10-kDa, 8-kDa 정도의 크기를 갖는 것으로 나타났다. 이들을 spots에 대하여 MALDI-TOF를 이용하여 in-gel digestion으로 N-terminal microsequencing을 실시하였다. 그 결과 2,4-D 또는 2,4,5-T에 의해 유도된 단백질#1은 internal sequence가 $^1$GEAYFVDNNSLR$^1^2$로서 이는 pyruvate dehydrogenase의 dihydrolipamide dehydrogenase와 유사한 아미노산 서열인 것으로 확인되었으며, 단백질 #2의 internal sequence는 $^1$QDEVNA$^6$로서 alanine dehydrogenase, 그리고 #3의 internal sequence는 $^1$TDTLVLGAG$^9$로서 pyruvate dehydrogenase의 dihydrolipoamide acetyltransferase E3 subunit으로 각각 확인되었다. Pseudomonassp. HK-6의 실험에서 약 70-kDa DnaK 와 60-kDa GroEL의 두 스트레스 단백질이 atrazine에 대한 세포반응으로 HK-6 세포에서 발견되었다. SDS-PAGE와 Western blot 분석을 통하여 SSPs가 2-8시간동안 0.35 mM atrazine과 0.075 mMsimazine에 노출된 세포에서 유도됨이 확인되었다. 최대 단백질 유도는 atrazine이나 simazine에 노출된 Pseudomonas sp. HK-6 세포에서 배양 6시간만에 나타났다. Atrazine에 노출된 Pseudomona sp. HK-6 배양으로부터 수용성 단백질 분획의 2-D PAGE롤 통하여 많은 spots가 pH 3에서 pH 10 범위에서 은으로 염색된 젤에서 관찰되었다. 그들 가운데 atrazine에 대한 반응으로 현저하게 유도되고 발현된 12 개의 spots가 선택되고 분석되었다. 젤 상에서 크게 발현되어 나타난 대략60-kDa 단백질을 대상으로 아미노산 서열결정을 실시하였다. In-gel digestion으로 N-terminal microsequencing을 실시하였으며 그 결과 atrazine과 simazine에 의해 유도된 단백질의 N-terminal sequence는 $^1$XXAKDVKFGDSARKKML$^1^7$으로 Pseudomonas putida의 GroEL(P48216)의 N-terminal sequence인 $^1$MAAKDVKFGDSARKKML$^1^7$과 동일한 것으로 확인되었다.

Abstract ▼

The cellular responses and induced proteom analysis of soil-borne bacteria, Burkholderia sp. YK-2 and Pseudomonas sp. HK-6 to pesticides 2,4-D, 2,4,5-T, atrazine, and simazine were investigated. Initially, we examined the cellular responses of strain YK-2 to stresses induced in response to the pesti

The cellular responses and induced proteom analysis of soil-borne bacteria, Burkholderia sp. YK-2 and Pseudomonas sp. HK-6 to pesticides 2,4-D, 2,4,5-T, atrazine, and simazine were investigated. Initially, we examined the cellular responses of strain YK-2 to stresses induced in response to the pesticides 2,4-D or 2,4,5-T. 43-kDa DnaK and 41-kDa GroEL proteins were synthesized in Burkholderia sp. YK-2 in response to sublethal concentrations of 2,4-D and 2,4,5-T stresses, respectively. Strain YK-2 exhibited a more sensitive response to 2,4,5-T stress than to 2,4-D stress as manifest in physiological and morphological changes, suggesting a greater cytotoxic effect of 2,4,5-T. SEM analyses revealed the presence of perforations and irregular rod forms with wrinkled surfaces for cells treated with either pesticide. These irregularities were found more frequently for 2,4,5-T-treated cells than for 2,4-D-treated cells. Analysis of cellular fatty acids showed similar effects in the shifts of total cellular fatty acid composition in response to 2,4-D and 2,4,5-T. Strain YK-2 could degrade 2.25 mM 2,4-D completely during 28 hours of incubation with transient production of 2,4-dichlorophenol as a metabolite, however, 2,4,5-T was not catabolized at any of the concentrations tested. Biolog and 16S rDNA analyses revealed that strain YK-2 was 98% similar to the Burkholderia cepacia species, therefore we have designated this strain as B. cepacia YK-2. Three spots (called proteins #1, #2, #3) were significantly induced and expressed in response to 2,4-D / 2,4,5-T. The size of induced proteins were 30-kDa, 10-kD, and 8-kDa, respectively. These three proteins, which were assumed highly expressed on the gel, was used for amino acid sequencing. N-terminal microsequencing with in-gel digestion of these spots using MALDI-TOF was performed. As the results, the internal sequences of the 2,4- and 2,4,5-T-induced proteins, protein #1 showed that $^1$GEAYFVDNNSLR$^1^2$, shared the similarity with dihydrolipamide of pyruvate dehydrogenase, protein #2 was $^1$QDEVNA$^6$, alanine dehydrogenase, and protein #3 was $^1$TDTLVLGAG$^9$, dihydrolipoamide acetyltransferase E3 subunit of pyruvate dehydrogenase, respectively. In the experiments of Pseudomonas sp. HK-6, two stress shock proteins (SSPs), approximately 70-kDa DnaK and a 60-kDa GroEL were found in HK-6 cells in response to atrazine and simazine. Analyses of SDS-PAGE and Western blot using anti-DnaK and GroEL revealed that SSPs were induced in HK-6 cells exposed to 0.35 mM of atrazine and 0.075 mM of simazine for 2-8 hrs, respectively. The maximum induction of proteins was achieved at 6-hrs incubation point after HK-6 cells' exposure to atraine or simazine. 2-D PAGE of soluble protein fractions from the culture of Pseudomonas sp. HK-6 exposed to atrazine demonstrated that many spots were observed on the silver stained gels ranging from pH 3 to pH 10. Among them, 12 spots significantly induced and expressed in response to atrazine were selected and analyzed. Approximately 60-kDa protein, which was assumed highly expressed on the gel, was used for amino acid sequencing. N-terminal microsequencing with in-gel digestion showed that N-terminal sequence of the atrazine- and simazine-induced protein, $^1$XXAKDVKFGDSARKKML$^1^7$, shared extensive similarity with $^1$MAAKDVKFGDSARKKML$^1^7$, N-terminal sequence of (P48216) GroEL of Pseudomonas putida.

목차 Contents

• 1. 연구계획 요약문(국문)...3
• 2. 연구결과 요약문...4
• (국문)...4
• (영문)...6
• 3. 참여연구진...8
• 4. 연구결과...9
• 가. 서론...9
• 나. 연구방법 및 이론...10
• 다. 결과 및 고찰...16
• 라. 결론...50
• 마. 인용문헌...51