초록 ▼

본 연구는 영장류를 이용한 생식독성 동태시험법을 확립하기 위하여 실시하였음. 배 태자 발생 독성동태 시험(태반이행)을 위하여 6~7 년령, 체중 4~6 kg의 성성숙한 수컷 게잡이 원숭이 12마리와 5-7 년령, 2.5-4.5 kg의 정상적인 월경주기를 나타내는 암컷 원숭이 24마리를 선별하여 교배시킨 후 교배 후 20일 전에 초음파기를 이용하여 임신여부를 확인하였음 임신이 확인된 동물에 대하여 valproic acid(VPA)를 0, 20, 60 및 180 mg/kg의 용량으로 용량별로 2마리씩 임신 20일째부터 임신 50일째까지

본 연구는 영장류를 이용한 생식독성 동태시험법을 확립하기 위하여 실시하였음. 배 태자 발생 독성동태 시험(태반이행)을 위하여 6~7 년령, 체중 4~6 kg의 성성숙한 수컷 게잡이 원숭이 12마리와 5-7 년령, 2.5-4.5 kg의 정상적인 월경주기를 나타내는 암컷 원숭이 24마리를 선별하여 교배시킨 후 교배 후 20일 전에 초음파기를 이용하여 임신여부를 확인하였음 임신이 확인된 동물에 대하여 valproic acid(VPA)를 0, 20, 60 및 180 mg/kg의 용량으로 용량별로 2마리씩 임신 20일째부터 임신 50일째까지 1일 1회 경구 투여하였음. 임신 20일 및 임신 50일째에 일정 시간 간격으로 모동물의 혈액을 채취하여 혈중 시험물질 농도를 측정하였고, 임신 50일째에 시험물질 투여 후 모동물을 마취시켜 제왕절개를 실시한 다음 태자를 적출하여 태자 및 양수에서의 시험물질의 농도를 측정하여 시험물질의 태반통과 여부를 검사하였음. 투여기간 중에는 투여전후 1회씩 일반증상을 관찰하였고, 모동물의 체중과 사료섭취량을 측정하였으며, 배자의 생존상태를 확인하기 위해 임신 25, 35 및 45일째에 초음파기를 이용하여 심박과 성장상태를 관찰하였음.
시험기간중 시험물질 투여에 기인한 일반증상, 체중 및 사료섭취량 변화는 관찰되지 않았음.
VPA를 임신동물에 임신 20일에 단회 투여하였을 때, 모든 투여용량에서 24시간까지 혈장 중에서 VPA가 정량한계(0.5 $\mu g/mL$ 이상으로 검출되어, 모체가 시험물질에 전신적으로 노출(systemic exposure)됨을 알 수 있었음. 용량증가에 따른 VPA의 전신노출($AUC_{last}$로 측정)은 20 mg/kg/day에서 60 mg/kg/day 사이에는 큰 차이가 없었으나, 60 mg/kg/day에서 180 mg/kg/day 사이에는 증가하였다. 임신 20일부터 임신 50일까지 반복투여 후 임신 50일째에 제왕절개하여 채취한 양수, 태반 및 태자시료 모두에서 VPA가 정량한계 이상으로 검출되어, 시험물질의 노출이 확인되었고, 용량증가에 따라 양수, 태반 및 태자에 대한 노출이 증가하였음. VPA의 주 독성 대사체인 4-ene valproic acid (4-ene VPA)의 모체혈액 중 농도는 parent drug인 VPA 보다 매우 낮은 $C_{max}$와 $AUC_{last}$가 각각 valproic acid의 0.3-0.7% 및 0.3-1.4%였으며, $T_{max}$는 valproic acid의 1.5-3배로서 parent drug보다 늦게 최고혈중농도에 도달하였음. 임신 50일째에 제왕절개하여 채취한 양수와 태자시료에서는 4-ene VPA가 검출되지 않았으나, 태반시료에서는 4-ene VPA의 농도가 최저정량한계(0.5 $\mu g/mL$ 및 0.5 $\mu g/g$ 이상으로 검출되었음. 태반시료 중 4-ene VPA의 농도는 용량증가에 따른 뚜렸한 변화 경향을 보이지 않았음.
출생전후 발생 및 모체기능 독성동태시험(유즙이행)을 실시하기 위하여 배한 암컷동물에 대해 교배 후 25일째에 초음파 검사를 통해서 임신여부를 확인하였음 임신이 확인된 동물에 대하여 VPA를 0, 30, 90 및 270 mg/kg의 용량으로 용량별로 2마리씩 임신 100일째부터 분만 후 31일째까지 1일 1회 경구 투여하였음. 단, 분만일은 투여하지 않았음. 임신 100일 및 140일째 그리고 포육30일째에 일정 시간 간격으로 모동물의 혈액을 채취하였고, 포육 31일째에 모유를 채취하여 혈중 및 모유중의 시험물질의 농도를 측정하여 시험물질의 유즙이행 여부를 검사하였음. 투여기간 중에는 투여전후 1회씩 일반증상을 관찰하였고, 모동물의 체중과 사료섭취량을 측정하였으며, 태자의 생존상태를 확인하기 위해서 임신 25, 40, 60, 90, 100, 110, 120, 130 및 140일째에 초음파기를 이용하여 심박과 성장상태를 관찰하였음.
시험물질 투여에 기인한 체중 및 사료섭취량의 변화는 관찰되지 않았음. 모든 생존태자에 있어서 외형이상은 관찰되지 않았고, 출생자의 체중에 있어서 시험물질의 영향은 관찰되지 않았음. VPA를 임신동물에 임신 100일째에 단회 투여하였을 때, 모든 투여용량에서 24시간까지 혈장 중에서 VPA가 정량한계 이상으로 검출되어, 모체가 시험물질에 전신적으로 노출됨을 알 수 있었음. 용량증가에 따른 VPA의 전신노출($AUC_{last}$로 측정)은 30 mg/kg/day에서 300 mg/kg/day 사이에서 용량상관성이 있었으나, 전 용량 증가율보다는 낮은 증가율을 보였음 4-ene VPA의 모체혈액중 농도는 매우 낮아 정량한계(0.5 $\mu g/mL$) 근처였음. 반복투여후 VPA의 모체혈액중 농도는 임신기 및 포육기(임신 140일째 및 포육 30일째) 모두에서 단회투여 임신 100일)후와 비교할 때 1/20-l/4로 감소하였음. 반복투여 후 4-ene VPA의 모체혈액 중 농도는 정량한계 이하였음. VPA를 임신동물에 임신 100일에서 포육 31일 까지 반복 투여한 후, 포육 30일 및 포육 31일째에 채취한 모유 및 신생자 혈액 중에 VPA가 검출되어, VPA가 모유를 통하여 신생자에게 이행됨을 알 수 있었음. 모유 및 신생자 혈액중의 VPA의 노출은 투여 용량 증가에 따라 증가하는 경향을 나타내었음. 4-ene VPA의 모체혈액 중 농도는 VPA 보다 낮았으며, 모유 및 신생자 혈액 중의 4-ene VPA의 농도는 정량한계(0.5 $\mu g/mL$)이 하였음.
결론적으로 임신 및 포육기(임신 100일-포육 31일)동안 모동물에 VPA를 반복 투여하였을 때, VPA는 모유를 통하여 이행되어 신생자가 VPA에 노출되었다. 모유 및 신생자의 VPA의 노출은 투여 용량의 증가에 따라 증가하였음 모유와 신생자 혈액중의 4-ene VPA의 농도는 정량한계 이하였음.

Abstract ▼

This study was conducted to establish reproductive toxicity and toxicokinetics using th non-human primate. Twelve males, aged 6-7 years, weighing 4-6 kg, and 24 females showing regular menstrual cycle, aged 5-7, weighing 2.5-4.5 kg were selected. Following cohabitation 0each adult male and female, m

This study was conducted to establish reproductive toxicity and toxicokinetics using th non-human primate. Twelve males, aged 6-7 years, weighing 4-6 kg, and 24 females showing regular menstrual cycle, aged 5-7, weighing 2.5-4.5 kg were selected. Following cohabitation 0each adult male and female, mating was confirmed by presence of sperms in vagina and pregnancy was determined by observing gestation sac in uterus using ultrasound after 18 or 19 days of mating for placenta transfer and 25 days of mating for milk transfer.
For placenta transfer of valproic acid (VPA), two pregnancy-proven monkeys per each group; were orally treated once a day with VP A at dose levels of 0, 20, 60 and 180 mg/kg during the organogenesis period from Day 20 to 50 of gestation. Plasma concentrations of VPA and its main toxic metabolite, 4-ene valproic acid (4-ene VPA) were measured on Days 20 and 50 of gestation and concentrations of VPA and the metabolite in placenta, amniotic fluid and fetus were also determined following Caesarean section on Day 50 of gestation. Daily clinical signs, body weight and food consumption were observed. Fetal growth and heart beat were examined on Days 25, 35 and 45 of gestation using ultrasound.
No treatment-related changes were observed in clinical signs, body weight and food consumption. Following single oral administration of VPA to pregnant monkeys on Day 20 of gestation, concentrations of VPA were generally quantifiable in the plasma from all treatment groups up to 24 hours post-dose, demonstrating that VPA was absorbed and that the monkeys were systemically exposed to VPA. There was no remarkable difference in the maternal systemic exposure (determined by $AUC_{last}$) between the monkeys dosed at 20 and 60 mg/kg/day, but systemic exposure to VPA was increased between 60 and 180 mg/kg/day.
After repeated administration of VPA from Day 20 to 50 of gestation, VPA was detected in amniotic fluid, placenta and fetus taken on Day 50 of gestation, demonstrating that VPA was 'transferred via placenta and the fetus was exposed to VPA. The exposures in amniotic fluid, placenta and fetus were increased with increasing dose. Plasma concentrations of 4-ene VPA were lower than the parent drug, resulting 0.3-0.7% and 0.3-1.4% of those of VPA in $C_{max}$ and $AUC_{last}$, respectively. Regarding the placenta transfer, the concentrations of 4-ene VPA in both amniotic fluid and fetus were under the lower limit of quantification (0.5 $\mu g/mL$ or 0.5 $\mu g/g$), but small amount of 4-ene VPA was detected in placenta. There was no remarkable increases of placenta transfer of the metabolite upon increase of the doses.
For milk transfer of VPA, two pregnancy-proven monkeys per each group were orally treated once a day with VPA at dose levels of 0, 30, 90 and 270 mg/kg from Day 100 of gestation to Day 31 of lactation. However, animals were not administered on parturition day. Plasma concentrations of VPA and its metabolite, 4-ene VPA, were measured on Days 100 and 140 of gestation and Day 30 of lactation, and concentrations of VPA and the metabolite in offspring blood and milk were also determined on Day 30 and 31 of lactation, respectively. Clinical signs, body weight and food consumption were observed. Fetal growth and heart beat were examined on Day 25, 40, 60, 90, 100, 110, 120, 130 and 140 of gestation using ultrasound. In addition, external abnormalities and body weights of F1 offspring were observed.
No treatment-related changes were observed in clinical signs, body weight, food consumption, land fetal growth. No external abnormalities were observed in all live neonates and no treatment-related change in body weight of Fl offspring was also observed in any of the treatment group.
Following single oral administration of VPA to pregnant monkeys on Day 100 of gestation, concentrations of VPA were generally quantifiable in the plasma from all treatment groups up to 24 hours post-dose, demonstrating that VPA was absorbed and that the monkeys were systemically exposed to VPA. The maternal systemic exposure (determined by $AUC_{last}$) was dose-related, but less than dose-proportional at dose levels between 30 and 270 mg/kg. Maternal plasma concentrations of 4-ene VPA were very low (near lower limit of quantification, 0.5 $\mu g/mL$). After repeated administration, the systemic exposure of VPA in mother on both gestation and lactation period (Day 140 of gestation and Day 31 of lactation) was decreased by about 1/20-1/4 comparing those after single administration (Day 100 of gestation). Maternal plasma concentrations of 4-ene VPA after repeated administration were under the lower limit of quantification (0.5 $\mu g/mL$).
After repeated administration of VPA from Day 100 of gestation to Day 31 of lactation, VPA was detected in milk and pup plasma taken on Day 30 and 31 of lactation, respectively, demonstrating that VPA was transferred via milk and the pup was exposed to VPA. There was increasing tendency in exposures of VPA in milk and pup plasma with increasing dose. Maternal plasma concentrations of 4-ene VPA was lower than the parent drug. Regarding the milk transfer, the concentrations of 4-ene VPA in both milk and pup plasma were under the lower limit of quantification (0.5 $\mu g/mL$).
In conclusion, when VPA was repeatedly administered to the mother monkeys during the gestation and lactation periods (Day 100 of gestation to Day 31 of lactation), VPA was transferred via milk and the pup was exposed to VPA. The exposures of VPA in milk and the pup were increased with increasing dose. The concentrations of 4-ene VPA in milk and the pup were under the lower limit of quantification.

목차 Contents

• 표지 ...1
• 용역연구개발과제 최종보고서 ...2
• 제출문 ...3
• 목차 ...4
• I. 연구개발결과 요약문 ...5
• 최종보고서 요약문 ...5
• Summary ...8
• II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...11
• 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...11
• 제1절 총괄연구개발과제의 목표 ...11
• 제2절 총괄연구개발과제의 목표달성도 ...13
• 제3절 국내.외 기술개발 현황 ...14
• 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ...15
• 제1절 생체시료분석법 개발 (Bioanalytical Method Development using LC/MS/MS) ...15
• 제2절 영장류를 이용한 valproic acid의 배.태자 발생 독성동태시험-태반통과 시험 ...18
• 제3절 영장류를 이용한 valproic acid의 출생 전.후 발생 및 모체기능 독성동태시험-모유통과 시험 ...20
• 제4절 영장류를 이용한 valproic acid의 배.태자 발생 독성시험-추가 시험 ...21
• 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...23
• 제1절 영장류를 이용한 valproic acid의 배.태자 발생 독성동태시험-태반통과 시험 ...23
• 제2절 영장류를 이용한 valproic acid의 출생 전.후 발생 및 모체기능 독성동태시험-모유통과 시험 ...30
• 제3절 영장류를 이용한 valproic acid의 배.태자 발생 독성시험-추가 시험 ...44
• 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...46
• 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과 ...48
• 5.1 활용성과 ...48
• 5.2 활용계획 ...49
• 제6장 기타 주요변경사항 ...49
• 제7장 참고문헌 ...49
• 제8장 첨부서류 ...50
• 별첨 : 영장류시험 관련 SOP ...54