초록 ▼

연구 목적
세포 카운터 셀렉스 방법을 확립하고 이 방법을 이용하여 HER-2 세포 표면 성장인자 수용체에 대한 압타머를 확보하고 항암 압타머로서의 기능을 위해 1) 압타머-siRNA conjugate를 이용한 암세포 특이적 siRNA 전달 및 세포 사멸 기술 개발, 2) 두 종류 이상의 발암 유전자를 동시에 억제하는 siRNA 개발 및 이를 통한 항암 효과를 규명한다.
연구 방법
1. HER-2에 대한 압타머를 확보하기 위해 기존 단백질 기반 셀렉스 방법에 비해 보다 효과적이고 선택적인 압타머를 획득할 수 있는 세포

연구 목적
세포 카운터 셀렉스 방법을 확립하고 이 방법을 이용하여 HER-2 세포 표면 성장인자 수용체에 대한 압타머를 확보하고 항암 압타머로서의 기능을 위해 1) 압타머-siRNA conjugate를 이용한 암세포 특이적 siRNA 전달 및 세포 사멸 기술 개발, 2) 두 종류 이상의 발암 유전자를 동시에 억제하는 siRNA 개발 및 이를 통한 항암 효과를 규명한다.
연구 방법
1. HER-2에 대한 압타머를 확보하기 위해 기존 단백질 기반 셀렉스 방법에 비해 보다 효과적이고 선택적인 압타머를 획득할 수 있는 세포 카운터 셀렉스 방법이 확립 되었다. 본 연구에서는 유방암 세포주 중 HER-2 수용체를 과발현 하는 세포주와 그렇지 않은 세포주를 이용하여 과발현하는 세포주에 결합할 수 있는 압타머를 확보하는 전략을 시도하였으며 추가로 HER-2 과발현 세포주에 siRNA를 처리하여 발현을 억제한 후 셀렉스를 진행하는 등의 세포 카운터 셀렉스 방법이 고안 및 확립 되었다.
2. 압타머-siRNA conjugate 항암 압타머를 개발하기 위해 본 연구에서는 우선 siRNA의 세포 도입에 의해 유도되는 생리적 현상을 규명하였으며, 압타머-siRNA conjugate를 위해 구조적으로 변형된 siRNA에 대한 테스트를 진행하였다. 또한 두 종류 이상의 유전자를 억제할 수 있는 다양한 siRNA 구조를 고안하고 세포에 처리하여 그 결과를 확인하였다.
연구 결과
1. 세포 카운터-셀렉스를 이용한 HER-2 압타머 스크리닝
상기의 세포 카운터-셀렉스 방법을 이용하여 HER-2 압타머 동정을 진행하였으며 세포주 간의 카운터 셀렉스를 통해 HER-2 과발현 세포에 보다 높은 결합력을 보이는 압타머 풀을 확보할 수 있었으며 이에 더해 siRNA를 이용한 카운터 셀렉스를 진행하여 HER-2에 대한 압타머를 확보할 수 있었다.
2. 암세포 특이적인 siRNA 전달 기술 개발
본 연구진은 암세포 특이적인 siRNA 전달 기술 개발을 위해 연구를 진행하는 과정에서 siRNA에 의한 비특이적인 염증 반응을 발견하였으며 이를 논문으로 보고 하였다. 또한 압타머-siRNA conjugate를 위해 linker 염기서열을 가지는, 기존의 siRNA와는 다른 구조를 가지는 siRNA를 고안하였으며 이러한 siRNA 구조가 siRNA 활성을 유지하면서 선천성 면역 반응을 일으키지 않는다는 사실을 확인하고 이를 학계에 보고 하였다.
3. 복수 유전자를 억제할 수 있는 siRNA 개발
복수의 유전가를 억제하기 위해 서로 다른 siRNA를 세포에 동시에 처리 해 본 결과 siRNA 활성간의 competition이 일어나는 현상을 관찰하였으며 siRNA의 antisense strand의 5'-end 부분의 서열이 competition potency를 결정짓는데 중요한 역할을 한다는 것을 발견하여 이를 학계에 보고하였다. 또한 동시에 두가지 이상의 유전자를 표적으로 할 수 있는 dual silencing siRNA, triple silencing siRNA 구조를 고안하고 세포에 처리하여 이러한 구조가 목표 유전자의 발현을 억제할 수 있음을 확인하는데 성공하였다.

Abstract ▼

Project object
1. Establishment and validation of cell counter-SELEX method and screening of HER-2 aptamer
2. Development of cancer cell specific aptamer-siRNA conjugate delivery technology
3. Development of multiple gene silencing siRNA
Project process
1. In this project, we establis

Project object
1. Establishment and validation of cell counter-SELEX method and screening of HER-2 aptamer
2. Development of cancer cell specific aptamer-siRNA conjugate delivery technology
3. Development of multiple gene silencing siRNA
Project process
1. In this project, we established cell counter-SELEX method for HER-2 aptamer screening. Cell counter-SELEX utilizes cell lines which show difference in HER-2 expression. We obtained two cell lines which over-express HER-2 or not and performed SELEX procedure. In addition, we also conducted counter-SELEX using HER-2 specific siRNA.
2. For the construction of anticancer aptamer-siRNA conjugate system, we firstly tested and characterized cell response upon siRNA transfection and examined structure modified siRNAs which have linker sequence for aptamer-siRNA conjugated. We also designed and investigated multiple gene silencing siRNA molecules.
Project results
1. HER-2 aptamer screening using cell counter-SELEX method
We performed cell counter-SELEX using both two cell lines method and siRNA method and succeeded in acquiring aptamer pool which showed high affinity to HER-2 over-expression cell line.
2. Development of cancer cell specific aptamer-siRNA conjugate delivery technology
1) Characterization of cellular response to siRNA transfection: We observed that siRNA delivery induces inflammatory cytokine gene expression and identified that those response is cell type- and transfection reagent-specific.
2) Examination of siRNAs which contain linker sequence for aptamer-siRNA conjugate: We designed aptamer-siRNA conjugate structure. In this conjugate structure, siRNA with extended linker sequence is required and we decided to examine this modified siRNA structure. The modified siRNA showed comparable siRNA efficiency and did not induce distinct antiviral response. We concluded that aptamer-siRNA conjugate can be used for cancer-cell specific siRNA delivery.
3. Development of multiple gene silencing siRNA
1) Characterization of siRNA competition: For multiple gene silencing, we transfected different siRNAs into cell and observed that siRNA activity was inhibited by other siRNA which was co-transfected. We characterized this siRNA competition phenomenon and reported results.
2) Development of multiple gene silencing siRNA: We designed and constructed siRNA which has novel structure for multiple gene silencing activity and transfection of those siRNAs (dual or triple silencing siRNA) resulted in significant reduction of target gene expression.

목차 Contents

• 암정복추진연구개발사업 최종연구개발결과보고서 서식 ...1
• 표지 ...5
• 제출문 ...7
• 목차 ...8
• I. 연구개발사업 최종연구개발결과보고서 요약문 ...9
• 한글요약문 ...9
• Project Summery ...11
• II. 연구개발과제 연구결과 ...13
• 1. 연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...13
• 2. 연구개발과제의 연구대상 및 방법 ...16
• 3. 연구개발과제의 연구개발결과 ...17
• 4. 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...33
• 5. 연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ...34
• 6. 연구개발과제의 활용계획 ...45
• 7. 참고문헌 ...45
• 8. 첨부서류 ...46
• [붙임1] 자체평가의견서 ...47
• [붙임2] 최종연구개발결과보고서 비공개 승인요청서 ...52
• [붙임3] 암정복추진연구개발사업 최종연구개발결고보고서 필수배포기관 ...53