초록 ▼

연구목표
<최종목표>
- Cell-SELEX 기법을 이용하여, 췌장암 특이적인 전이 인자를 발굴하고 바이오마커 및 치료 표적으로 활용함
<연차별 목표>
1) 췌장암 전이 동물 모델 및 세포 확립과 이를 이용한 Cell-SELEX 수행
2) 췌장암 세포 특이적 압타머 발굴 및 이를 이용한 췌장암 특이적 인자 동정
연구내용 및 방법
◆ 연구내용 및 방법
< 췌장암 전이 모델 확립 >
1) 췌장암 세포주 CFPAC-1을 이용한 orthotopic xenograft 모텔과 전이 모델 구축 및

연구목표
<최종목표>
- Cell-SELEX 기법을 이용하여, 췌장암 특이적인 전이 인자를 발굴하고 바이오마커 및 치료 표적으로 활용함
<연차별 목표>
1) 췌장암 전이 동물 모델 및 세포 확립과 이를 이용한 Cell-SELEX 수행
2) 췌장암 세포 특이적 압타머 발굴 및 이를 이용한 췌장암 특이적 인자 동정
연구내용 및 방법
◆ 연구내용 및 방법
< 췌장암 전이 모델 확립 >
1) 췌장암 세포주 CFPAC-1을 이용한 orthotopic xenograft 모텔과 전이 모델 구축 및 target 세포 확보
-Target cell: 전이되어 형성된 종양조직으로부터 분리한 세포로서 마우스 췌장에 재이식시, 침윤 및 전이가 가속화되는 양상을 보임 (Lu-M1 cell)
-Counter cell: normal human pancreatic ductal epithelial cell (HPNE)
< 췌장암 전이 세포 특이적 압타머 발굴>
1) Adherent Cell-SELEX 수행 및 optimization
- single-stranded DNA library의 design 및 제작: Cy5, Biotin conjugation
- aptamer 증폭기술 확립 : double-stranded DNA로부터 sense strand 분리 방법 안정화
- target cell 특이적 aptamer pool의 enrichment
2) 증폭된 aptamer pool의 세포 특이성 확인
- Flow cytometry 활용
3) 증폭된 aptamer pool의 cloning 및 sequence 분석과 motif 분류를 통해 aptamer 후보군 발굴 (12종)
4) candidate aptamer의 세포 특이성 및 결합친화도 확인
- target cell 및 암종별 세포주를 이용한 flow cytometry 분석 (4종)
- Cytochemistry를 통한 세포막 발현 분석 (4종)
- paraffin tissue histochemistry를 통한 췌장암 특이적 결합 확인 (최종 2종)

1) Proteomics를 이용하여 aptamer의 표적단백질 동정
- 세포막과 biotynylated aptamer의 pull down을 통해 표적 단백질 후보군을 분리하고 LC-MS/MS 방법으로 peptide sequence 동정
2) Proteomics에서 동정된 표적 막단백질의 발현 확인
- 항체를 이용한 발현 검증
3) 동정된 표적 단백질에 대한 aptamer의 특이적 결합능 검증
- 표적단백질 knock down 시스템에서 flow cytometry로 검증
연구개발에 따른 기대성과
<정량적 성과>
<정성적 성과>
- 췌장암 xenograft 및 전이 모델 구축
- Adherent cell을 이용한 Cell-based SELEX 기법의 안정적 구현 및 기술적 우위
- Cell-SELEX를 이용한 표적 분자 동정의 성공 사례
- 발굴된 표적 분자를 이용한 예후 및 신치료 target 으로의 발전 가능성

Abstract ▼

Pancreatic cancer is a highly lethal disease with the worst median survival rate (3% 5-year survival). Pancreatic cancer is usually detected in its late stages, and only 10- 15% of cases are operable. A large proportion of unresectable pancreatic cancers are locally invasive and metastatic. Therefor

Pancreatic cancer is a highly lethal disease with the worst median survival rate (3% 5-year survival). Pancreatic cancer is usually detected in its late stages, and only 10- 15% of cases are operable. A large proportion of unresectable pancreatic cancers are locally invasive and metastatic. Therefore, to identify the marker of pancreatic cancer metastasis can facilitate prognosis or development of effective therapeutics. Here we developed DNA aptamers targeting pancreatic cancer through cell-based SELEX (Systemic Evolution of Ligands by EXpotential Enrichment) method. Cell-SELEX has several advantages both to develop aptamer against target molecule and to identify target cell-specific specific marker as the nucleic acid-based antibody. To select pancreatic cancer-specific aptamer, we used Lu-M1 cells which was primary cultured mouse pancreatic cancer metastasis for positive selection. The 5th round pool showed significant enrichment from N40 Library conjugated Cy5 and biotin which was measured using flow cytometry analysis, and 5th round pool was cloned and sequenced; 12 independent DNA aptamer candidate sequences were obtained, which were validated by flow cytometry analysis and cellular staining. In addition, we identified Annexin AII as the target of SQ 8 aptamer through proteomics. Annexin AII on the cell surface and cytosol of pancreatic cancer cells supports its potential use in detection of pancreatic cancer stage-dependent manner.
Taken together, we achieved the stable Cell-SELEX technology and further identified target of aptamer. We hope that it will be utilized and developed as a new therapeutic target for cancer therapy.

목차 Contents

• 기관고유연구사업 최종보고서 ... 1
• 목차 ... 2
• 요약문 ... 3
• Project Summary ... 5
• 1. 연구의 최종목표 ... 6
• 2. 연구의 내용 및 결과 ... 6
• 2.1. 연구수행 방법 ... 6
• 2.2. 연구수행 내용 및 결과 ... 9
• 3. 연구결과 고찰 및 결론 ... 17
• 1) Cell-SELEX 기법의 활용 가능성 증명 ... 17
• 2) Cell-SELEX 기법의 안정화 및 기술적 우위 마련 성과 ... 17
• 4. 연구성과 및 목표달성도 ... 18
• (1) 연구성과 ... 18
• (2) 목표달성도 ... 18
• 5. 연구결과의 활용계획 ... 19
• (1) 연구종료 2년후 예상 연구성과 ... 19
• (2) 연구성과의 활용계획 ... 19
• 6. 참고문헌 ... 20
• 7. 첨부서류 ... 20
• 끝페이지 ... 21