초록 ▼

인체의 면역체계를 이용하여 암을 치료하려는 연구는 암특이적 치료, 전이 억제 및 낮은 부작용 가능성 등 다른 치료방법들의 단점들을 극복할 수 있기에 많은 관심을 갖게 되었다. 최근에 기존 백신들의 면역학적 결함을 제거하고 암세포들을 죽이기에 충분한 면역 반응을 일으키기 위해 항암 면역기전에 관여하는 여러 유전자들 (cytokines, MHC 항원, 종양 항원, B7 등) 을 직접 암 세포에 도입한 항암 세포백신을 만들고, 이 백신을 이용해 암을 면역학적으로 치료하려는 연구들이 활발히 진행 중이다. 본 연구자는 신규 cytokine

인체의 면역체계를 이용하여 암을 치료하려는 연구는 암특이적 치료, 전이 억제 및 낮은 부작용 가능성 등 다른 치료방법들의 단점들을 극복할 수 있기에 많은 관심을 갖게 되었다. 최근에 기존 백신들의 면역학적 결함을 제거하고 암세포들을 죽이기에 충분한 면역 반응을 일으키기 위해 항암 면역기전에 관여하는 여러 유전자들 (cytokines, MHC 항원, 종양 항원, B7 등) 을 직접 암 세포에 도입한 항암 세포백신을 만들고, 이 백신을 이용해 암을 면역학적으로 치료하려는 연구들이 활발히 진행 중이다. 본 연구자는 신규 cytokine p43(AIMP1)이 대식세포로부터 IL-12를 생성하고, 항암면역반응에 관여하는 T helper type(Th1) 면역반응을 유도함을 증명하였고, SB5b 유방암 세포가 자라는 생쥐의 생존기간을 증가시킴을 관찰할 수 있었다. 따라서 본 과제에서는 p43의 항암효과를 보다 다양한 mouse tumor models애서 증명하고, 그 효과를 최적화하고자 함. 또한 항암효과를 세포면역학적 수준에서 작용 기전을 규명하고자 함.
p43의 면역학적 역할을 규명하기 위해서 수지상세포의 활성화 및 성숙화에 미치는 영향을 살펴보았다. p43 단백질을 수지상세포에 처리한 후 수지상세포의 변화를 flow cytometry, ELSA, cytokine oligochip 등의 방법으로 확인한 결과, p43에 의해서 수지상세포가 활성화 및 성숙화가 유도됨을 알 수 있었다. 또한, p43에 의해서 활성화된 수지상세포의 세포내 기전을 살펴보기 위해서 gel shift assay, western blot, flow cytometry, ELISA 등을 통해 확인하였다. 이를 통해, p43은 수지상세포내의 NF-kB 활성을 일으키고 이를 통해 수지상세포를 활성화시킴을 밝혔다. 또 다른 p43의 면역학적 역할로 innate immunity 에 중요한 수용체인 TLRs의 발현에 미치는 영향을 RT-PCR, western blot, ELISA를 통해 조사하였다. p43에 의해서 TLR의 발현이 증가하고 이를 통해서 pathogen에 대한 세포의 민감도가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
이러한 p43의 면역학적 역할을 안정적으로 생체내에 적용하고자 p43 DNA 백신을 다양한 형태로 제조, 적용해보았다. 제조된 p43 DNA 벡터가 HeLa 세포에서 발현되는 것을 western blot으로 확인하였고, 또한 p43 발현벡터가 존재하는 섬유아세포로부터 p43 단백질이 분비되는 것을 ELISA를 이용하여 확인하였다. p43 발현벡터를 생쥐에 주입하였을 때 $anti-IgG_{2a},\;IFN{\gamma}$의 생성이 증가되는 것을 ELISA를 확인할 수 있었다.
p43 발현벡터에 의한 생쥐의 Th1 면역반응이 항암작용으로 이어지는 지 알아보고자 하였다. 이를 위해서 in vivo mouse tumor model로 OVA-expressing EL4 lymphoma(EG7)에서 p43 DNA 벡터의 항암작용을 조사하였다. p43을 발현하는 섬유아세포의 항암세포독성을 ${}^{51}Cr$-release assay으로 확인하였다. p43을 발현하는 섬유아세포에서 항암세포독성이 높아짐을 확인할 수 있었다. 항암작용이 생쥐 생체내에서의 어떤 면역세포에 의해서 이루어지는 지 알아보기 위해서, 특정 세포의 항체를 사용해서 생체내에서의 면역세포를 없앤 후 항암작용의 변화를 살펴보았다. CD8+ T 세포가 결핍된 경우 p43 발현하는 섬유아세포의 항암작용이 현저히 떨어짐을 mouse survival rate를 통해 알아보았고 이를 ${}^{51}Cr$-release assay로 다시 확인하였다.

Abstract ▼

Anti-cancer immunotherapy is raising interest because of tumor-specific remedy, inhibitory angiogenesis and lower rate of side effects. It is investigated to make anti-caner cellular vaccine which enhance immune response enough for tumor regression via expressing the several anti-cancer genes (cytok

Anti-cancer immunotherapy is raising interest because of tumor-specific remedy, inhibitory angiogenesis and lower rate of side effects. It is investigated to make anti-caner cellular vaccine which enhance immune response enough for tumor regression via expressing the several anti-cancer genes (cytokines, MHC antigen, tumor antigen, B7, etc). Previously, we demonstrated that cytokine p43 (AIMP1) induce the IL-12 production from macrophages, leading to T helper type 1 (Th1) immune responses, which can mediate anti-cancer effect. We will search and optimize the anti-cancer effect of p43 in mouse tumor models. The mechanism of anti-cancer effect by p43 is also investigated in immune cells.
To investigate the immunological role of p43, we checked effect of p43 on activation and maturation of dendritic cells. p43 induced the activation and maturation of dendritic cells, which were determined by flow cytometry, ELISA and cytokine oligochip. Furthermore, we demonstrated that p43 induced the activation of dendritic cells via NF-kB activation, which were determined by gel shift assay, wetsern blot, flow cytometry and ELISA. p43 also induced the up-regulation of TLRs expression, expecially TLR2 and 4, which were determined by RT-PCR, western blot and ELISA. Up-regulated TLR expression increased the sensitivity of TLR against TLR4 ligand (LPS).
We manufactured the various form of p43 DNA vector for helping the immunological effect of p43 in vivo. It is confirmed that recombinant anti-CD3sFv/AIMP1 protein was expressed in transfected HeLa cells. Secreted AIMP1 was also checked in AIMP1/B7.1/OVA -transfected fibroblasts by ELISA. Importantly, increased levels of anti-IgG2a and $IFN{\gamma}$ was detected in mice injected with anti-CD3sFv/AIMP1 by ELISA , indicating that anti-CD3sFv/AIMP1 may induce Th1 response.
To confirm p43-induced Th1 response can mediate anti-cancer effect, we checked mouse survival rate in OVA expressing EL4 lymphoma(EG7) mice by administrating p43- expressing fibroblasts. Cytolytic activity of p43-expressing fibroblasts was determined by ${}^{51}Cr$-release assay. Cytolytic activity was increased in p43-expressing fibroblasts. To investigate which immune cells are involved in this anti-cancer effect by p43-expressing fibroblasts, we depleted the immune cells by specific antibodies. The anti-cancer effects of p43-expressing fibroblasts was remarkably decreased by depleting CD8+ T cells. which were determined by mouse survival rate and ${}^{51}Cr$-release assay.

목차 Contents

• 표지...1
• 제출문...3
• 목차...4
• I. 연구개발결과 요약문...5
• 연구개발사업 최종연구개발결과보고서 요약문...5
• Project Summary...6
• II. 연구개발과제 연구결과...7
• 1. 연구개발과제의 최종 연구개발 목표...7
• 2. 연구개발과제의 연구대상 및 방법...15
• 3. 연구개발과제의 연구개발결과...22
• 4. 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...35
• 5. 연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...38
• 6. 연구개발과제의 활용계획...43
• 7. 참고문헌...44
• 8. 첨부서류...45
• [붙임1] 자체평가의견서...46