초록 ▼

연구의 최종 목적: TGF-beta에 의한 oncogenic epithelial-to-mesenchymal transition(암세포의 중 간엽세포화: 이하 EMT)에 있어서 항산화효소들의 역할과 작용기작을 탐색함으로서 종양의 전이에 관련된 질환 치료제 개발에의 응용 가능성을 모색하는 것을 목적으로 하고 있음.
연구방법: 암세포의 EMT는 암세포의 침윤(invasion)과 전이 (metastasis)를 촉진하는 중요한 과정으로 이해되고 있고, 이 과정에서 활성산소종은 암전이의 매개인자로 작용하는 것으로 추정되고 있으나, 현재까

연구의 최종 목적: TGF-beta에 의한 oncogenic epithelial-to-mesenchymal transition(암세포의 중 간엽세포화: 이하 EMT)에 있어서 항산화효소들의 역할과 작용기작을 탐색함으로서 종양의 전이에 관련된 질환 치료제 개발에의 응용 가능성을 모색하는 것을 목적으로 하고 있음.
연구방법: 암세포의 EMT는 암세포의 침윤(invasion)과 전이 (metastasis)를 촉진하는 중요한 과정으로 이해되고 있고, 이 과정에서 활성산소종은 암전이의 매개인자로 작용하는 것으로 추정되고 있으나, 현재까지 상호간의 구체적인 기전이나 관련 분자 순주에서의 연구는 많이 이루어지지 않고 있음. 본 과제는 TGF-beta 에 의해 매개되는 병적인 oncogenic EMT에서 항산화효소들의 감소에 의해 활성산소종이 증가되고/ 증가된 활성산소종에 의해 oncogenic EMT가 매개될 수 있다는 가설을 세우고 이를 증명하고자 함. 이와 관련하여 다음과 같은 연구를 수행하였음.
$\cdot$ 마우스 유선세포주인 Eph4 세포주와 TGF-beta에 의한 oncogenic EMT가 유발되는 Eph4-Ras 세포주에서 활성산소종의 증감 분석과 항산화단백질과의 연관성 규명
$\cdot$ Eph4 세포주와 Eph4-Ras 세포주에서 TGF-beta 처리시 항산화단백질인 Glutaredoxin 1(Grx1)의 발현 변화 분석
$\cdot$ 항산화단백질인 Grx1이 과발현 되었을 때 TGF-beta에 의해 유도되는 Eph4-Ras 세포주에서 EMT 억제 현상 확인
$\cdot$ 항산화 단백질인 Grx1 과발현시 활성산소종이 발현 변화를 확인하고 TGF-beta 매개 EMT, Grx1, 활성산소종과의 연관성 확인
$\cdot$ Eph4-Ras 세포주에서 TGF-beta에 의한 Grx1 발현 감소와 관련된 신호전달 경로 규명
$\cdot$ Grx1 과발현에 관련된 유전자의 총체적 분석을 통한 새로운 EMT 관련인자 탐색
연구결과: 본 과제는 암의 전이 및 침윤과정에서 중요한 역할을 하는 TGF-매개 oncogenic EMT 현상이 TGF-beta 매개 항산화단백질인 Grx1의 발현감소와 Grx1 발현감소에 기인한 통한 활성산소종의 증가가 중요한 역할을 담당하고 있음을 규명하였음.
oncogenic EMT 유도 인자로서 TGF-beta의 역할과 활성산소종의 기능은 개별적인 연구를 통해 알려져 있으나. TGF-beta 사이토카인과 활성산소종, 그리고 항산화 단백질인 Grx1과의 상호연관성은 본 연구를 통하여 최초로 규명되었음.
본 연구과제에서 규명된 연구결과는 다음과 같음.
$\cdot$ Eph4-Ras 세포주에 TGF-beta에 의해 유도되는 oncogenic EMT 과정에서 활성산소가 증가함을 확인하였고, 활성산소종 제거제인 N-acetyl-cyteine (NAC) 처리시 TGF-beta에 의한 EMT 현상이 감소됨을 확인하였음.
$\cdot$ TGF-beta에 의한 Eph4-Ras 세포주의 EMT 유도에서 활성산소종의 증가는 항산화단백질인 Grx1 단백질의 발현감소와 특이적으로 관련되어 있음을 확인.
$\cdot$ Grx1 단백질이 과발현 되는 Eph4-Ras 세포의 경우 TGF-beta에 의한 EMT가 억제됨을 epithelial marker (E-cadherin, ZO-1)와 mesenchymal marker(alpha-SMA, vimentin) 단백질들의 western blot과 면역형광법으로 확인하였음.
$\cdot$ Grx1 단백질의 과발현은 실질적으로 Eph4-Ras 세포주의 활성산소종의 발현 감소를 유발함을 확인하였음.
$\cdot$ 이러한 결과는 마우스 유선 상피세포주인 Eph4-Ras 세포주의 TGF-beta 매개 EMT 현상은 TGF-beta에 의한 항산화단백질인 Glutaredoxin 1 발현의 감소를 통한 활성산소종의 증가가 중요한 역할을 담당하는 것을 증명하는 것임.
$\cdot$ Eph4-Ras 세포주에서 TGF-beta에 의한 Grx1 유전자의 발현 감소는 세포내의 PI3 kinase/MEK pathway를 통하여 유발됨을 확인하였음.
$\cdot$ Grx1 단백질이 과발현시 TGF-beta에 의해 조절되는 유전체를 분석하여 Grx1에 의해 조절되는 유전자 후보군을 그룹핑하였음.
연구개발에 따른 기대성과: TGF-beta와 항산화효소인 Grx1, 활성산소종(ROS) 이 EMT 현상을 유발하는 새로운 기전임을 증명함으로서 TGF-beta에 의해 매개되는 oncogenic EMT 현상을 제어할 수 있는 새로운 표적으로서 Grx1과 활성산소종의 가능성을 제시함.

Abstract ▼

Specific Aim in this study: Transforming growth factor-beta (TGF-beta) has been known as an important cytokine inducing epithelial-to-mesenchymal transition (EMT), which is a crucial morphological event during wide ranges of physiological and pathological cellular processes. Other studies also indic

Specific Aim in this study: Transforming growth factor-beta (TGF-beta) has been known as an important cytokine inducing epithelial-to-mesenchymal transition (EMT), which is a crucial morphological event during wide ranges of physiological and pathological cellular processes. Other studies also indicated that the intracellualr ROS level plays an important roles in tumor progression and metastasis. In addition, the intracellualr ROO levels are carefully regulated by several anti-oxidant pro tens, including glutaredoxin 1 (Grx1). Although there are independently considerable reports about TGF-beta, anti-oxidant Grx1 protein, and EMT phenotype, little is known about a distinct role of Grx1 regulating ROS levels during TGF-beta-induced EMT in tumoringenesis. In this study, we hypothesize that the reduced expression of Grx1 by TGF-beta1 is involved in TGF-beta-induced EMT of EpRas cells through increasing intracellular ROS level.
Materials and study designs: In this study, we usedEph4-Ras cells, which are H-Ras-transformed Eph4 mouse mammary epithelial cells. TGF-beta1 induces EMT phenotype of Eph4-Ras cells, but not the parental Eph4 cells. This is the reason we used these cells as our model system. In order to provide the evidence supporting our hypothesis, we performed the following experiments.
$\cdot$ Analysis of the intracellular concentration of reactive oxygen species (ROS) in mouse mammary epithelial Eph4 and Eph4-Ras cells in the absence or presence of TGF-beta
$\cdot$ Characterization of a distinct role of intracellular ROS in TGF-beta-induced EMT of Eph4-Ras cells
$\cdot$ Expressions of anti-oxidant proteins including Grx1 upon treatment of TGF-beta in Eph4 and Eph4-Ras cells.
$\cdot$ Analysis of EMT phenotype in Grx1-expressing Eph4-Ras cells in the presence of TGF-beta1: Analysis of expressions of epithelial markers (E-cadherin and ZO-1) and mesenchymal markers (vimentin and alpha-smooth muscle actin)
$\cdot$ Analysis of the intracellular concentration of ROS and the activity of Grx1 protein in Grx1-overexpressing Eph4-Ras cells in the presence or absence of TGF-beta1
$\cdot$ Cloning of Grx1 promoter and construction of serial deletion mutants of Grx1 promtoer
$\cdot$ Characterization of cis-acting elements of Grx1 promoter and signaling pathways responsible for the reduced expression of Grx1 gene upon treatment of TGF-beta
$\cdot$ Genome-wide microarray analysis to identify the genes regulated by TGF-beta in the presence of Grxl overexpression
Results: In this study, we demonstrate that TGF-beta induces EMT phenotype through decreasing the expression of Grxl gene, one of antioxidant enzyme, in H-Ras transformed Eph4 mammary epithelial cells (Eph-Ras), but not parental Eph4 cells. The reduced expression of Grx1 by TGF-beta1 caused the increase of intracellular reactive oxygen species (ROS) in Eph4-Ras cells and pre-treatment of N-acetyl-cysteine (NAC), a scavenger of ROS, inhibited TGF-beta-induced EMT. Grx1-overexpressing Eph4-Ras cells reduced intracellular ROS generation and abolished the expressions of mesenchymal markers upon treatment of TGF-beta1. In addition, the decreased expression of Grx1 by TGF-beta1 was mediated by PI3 kinase and MEK signalings, depending on Ras protein. Thus these findings strongly suggest that TGF-beta promotes EMT by increasing intracellular ROS level via down-regulation of Grx1 gene.

목차 Contents

• 연구개발과제 연구결과 ...8
• 1. 연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...8
• 2. 연구개발과제의 연구대상 및 방법 ...12
• 3. 연구개발과제의 연구개발결과 ...14
• 4. 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...32
• 5. 연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ...35
• 6. 연구개발과제의 활용계획 ...43
• 7. 참고문헌 ...44
• 8. 첨부서류 ...46