초록 ▼

1. 중간엽줄기세포의 면역조절 능력 확인을 위한 기반기술
○ 중간엽줄기세포의 분리 및 다분화능 확인
마우스의 골수세포에서 중간엽줄기세포를 분리하여 배양, 증폭하였고, 면역학적으로 CD34, CD45에는 음성이고, 내피세포 표현형인 CD31에 음성이면서, 줄기세포 표지자인 CD106+, CD73+, CD105+로 표현되는 중간엽줄기세포임을 확인하였다. methylcelluose 배지에서 CFU-fibroblast를 형성하였고 지방세포로 분화되었다.
○ 중간엽줄기세포의 면역조절기전 규명
중간엽줄기세포는 수지상세포의

1. 중간엽줄기세포의 면역조절 능력 확인을 위한 기반기술
○ 중간엽줄기세포의 분리 및 다분화능 확인
마우스의 골수세포에서 중간엽줄기세포를 분리하여 배양, 증폭하였고, 면역학적으로 CD34, CD45에는 음성이고, 내피세포 표현형인 CD31에 음성이면서, 줄기세포 표지자인 CD106+, CD73+, CD105+로 표현되는 중간엽줄기세포임을 확인하였다. methylcelluose 배지에서 CFU-fibroblast를 형성하였고 지방세포로 분화되었다.
○ 중간엽줄기세포의 면역조절기전 규명
중간엽줄기세포는 수지상세포의 성숙 및 이동이 지연시킴을 확인하였고 이는 용량에 비례하였다.
이는 이동억제관련 케모카인 수용체인 CCR1의 과잉발현의 결과이고 이 역시 중간엽줄기세포의 용량에 비례함을 알 수 있었으나 면역억제 관련사이토카인 (IL-10, IL-12)의 분비량 증가를 유도하지는 않았다.
2. in vitro GVHD 치료효과 평가 방법
○ Mixed lymphocytic culture 방법
세포의 CFSE uptake의 정도를 측정하여 T-세포 억제 효과를 분석하였는데 중간엽줄기세포의 주입용량에 비례함을 확인하였고 Thymidine uptake의 정도를 측정한 결과 중간엽줄기세포와 T-세포의 비율이 1:1 혹은 1:2가 가장 적정 용량으로 결정할 수 있었다.
3. in vivo GVHD 치료효과 평가 방법
○ T-세포를 이용한 GVHD 모델 제작 및 확인
이식받은 마우스의 골수, 흉선, 비장에서 donor 세포가 착생됨을 확인하였고, 8Gy 용량의 방사선 조사후 T세포이식 방법으로 GVHD 마우스 모델을 제작하였다.
○ 중간엽줄기세포 이식 후 육안적 및 조직학적 GVHD 치료 효과를 판정
GVHD 마우스 군은 지속적으로 육안적 평가점수가 심각한데 비해 대조군과 중간엽줄기세포 주입군에서는 시간이 지날 수록 호전됨을 확인하였다.
중간엽줄기세포 이식 후 조직학적점수가 소장, 피부, 대장에서 호전됨을 확인하였다.
○ 중간엽줄기세포 이식 후 바이오이미징시스템에 의한 GVHD 치료 효과 판정
Donor 세포를 GFP 혹은 RFP 마우스로 하여 IVIS-200에 의해 세포이동양상을 확인하는 선행연구가 진행되었고 중간엽줄기세포 이식 후 변화를 관찰 중이다.

Abstract ▼

1. Groundwork for confirming immunomodulatory capacity of mesenchymal stem cells
○ Confirmed mesenchymal stem cell separation and multi differentiation
By separating, culturing, and amplifying bone marrow cells from mice, we confirmed mesenchymal stem| cells that are immunologically negative f

1. Groundwork for confirming immunomodulatory capacity of mesenchymal stem cells
○ Confirmed mesenchymal stem cell separation and multi differentiation
By separating, culturing, and amplifying bone marrow cells from mice, we confirmed mesenchymal stem| cells that are immunologically negative for CD34, CD 45, phenotypically endothelial CD31, yet stem cell markers expressed as CD106+, CD73+, CD105+. We produced CFU-fibroblast from methylcellulose medium, which later differentiated into adipose cells.
○ Examined immunomodulatory mechanism of mesenchymal stem cell
We confirmed that mesenchymal stem cells are involved in the delay of dendritic cell maturation and migration, which effects are proportionate to the dosage used.
This, a result of the over-expression of the chemokine receptor CCR1 involved in migration suppression, was also proportionate to the dosage of mesenchymal stem cells used, however did not induce increased secretion of chemokines IL-10, IL-12 involved in immunosuppression.
2. Evaluating methods for in vitro GVHD treatment efficacy
○ Mixed lymphocytic culture Method
By measuring the degree of cell CFSE uptake, we analyzed the effects of T-cell suppression and confirmed that it was proportionate to the amount of mesenchymal stem cell injected. By measuring the degree of Thymidine uptake, we determined that the most appropriate titration dosage of mesenchymal stem cell to T-cell ratio was 1:1 or 1:2.
3. Evaluating methods for in vivo GVHD treatment efficacy
○ Production and confirmation of GVHD model using T-cells
We confirmed that donor cells were engrafted in the bone marrow, thymus, and spleen of the mouse that received transplantation, and consequently produced GVHD mouse model by transplanting T-cells after the process of radiation therapy with 8Gy.
○ Deciphering the gross and histological efficacy in treating GVHD with mesenchymal stem cell transplantation
The GVHD mouse group continually showed severe gross assessment, however the comparison group, which received mesenchymal stem cell injection, seem to show improvement as time progressed.
The small intestine, skin, and large intestine showed favorable progress with mesenchymal stem cell transplantation.
○ Evaluating GVHD treatment efficacy of mesenchymal stem cells using Bio-imaging system
Prior research using IVIS-200 for confirming cell migration patten was performed by using GFP or RFP mice as donor cells, which are now being applied in observing changes after mesenchymal stem cell transplantation.

목차 Contents

• 용역연구개발과제 최종보고서...1
• 표지...3
• 제출문...5
• 목차...6
• I. 연구개발결과 요약문...7
• 최종보고서 요약문...7
• Summary...9
• II. 총괄연구개발과제 연구결과...11
• 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...11
• 1.1 총괄연구개발과제의 목표...11
• 1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도...17
• 1.3 국내.외 기술개발 현황...18
• 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ...19
• 2.1. 마우스 준비...19
• 2.2. 마우스 중간엽줄기세포의 분리, 증폭 및 다분화능 확인...19
• 2.3. 중간엽줄기세포의 사이토카인 분비량 측정...19
• 2.4. 중간엽줄기세포의 Dendritic cell에 대한 면역반응 분석...20
• 2.5. 백혈구 혼합배양법 (Mixed leukocyte reaction)...21
• 2.6. regulatory T-세포 분석...21
• 2.7. 조혈모세포 이식 동물 실험 디자인...22
• 2.8. GVHD 평가...22
• 2.9. 이식 후 착생 확인...24
• 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...25
• 3.1. 중간엽줄기세포의 면역조절 능력 확인을 위한 기본 결과...25
• 3.2. 동물모델에서 in vitro GVHD 평가 표준화...26
• 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...39
• 4.1. 중간엽줄기세포의 면역조절 능력 확인을 위한 기본 결과...39
• 4.2. 동물모델에서 in vitro GVHD 평가 표준화...39
• 4.3. 동물모델에서 in vivo GVHD 평가 표준화...40
• 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과 ...42
• 5.1 활용성과...42
• 5.2 활용계획...43
• 제6장 기타 주요변경사항 ...43
• 제7장 참고문헌 ...44
• 제8장 첨부서류 ...45