초록 ▼

미국약전에 공개된 정보를 바탕으로 표준화에 적합한 재조합프로테인에이의 발현시스템을 재구축하고 이를 바탕으로 세포주은행 (Master cell bank) 을 구축하였다. 제조된 MCB를 사용하여 제조공정의 최적화 및 대량화 연구를 수행하여, 미국약전에 규정된 고순도 제품을 제조하면서도 경쟁사 대비 2배 이상의 생산성을 가지는 고효율 제조공정을 수립하였다. 한편 제품화에 요구되는 각종 분석법을 확립하였고, 개발된 공정과 분석법에 대하여 제조지시서 등 각종 필요한 문서체계를 구축하고 표준화 작업을 진행하여 상업적 생산에 대비한 기술개발체

미국약전에 공개된 정보를 바탕으로 표준화에 적합한 재조합프로테인에이의 발현시스템을 재구축하고 이를 바탕으로 세포주은행 (Master cell bank) 을 구축하였다. 제조된 MCB를 사용하여 제조공정의 최적화 및 대량화 연구를 수행하여, 미국약전에 규정된 고순도 제품을 제조하면서도 경쟁사 대비 2배 이상의 생산성을 가지는 고효율 제조공정을 수립하였다. 한편 제품화에 요구되는 각종 분석법을 확립하였고, 개발된 공정과 분석법에 대하여 제조지시서 등 각종 필요한 문서체계를 구축하고 표준화 작업을 진행하여 상업적 생산에 대비한 기술개발체계를 완성하였다.

목차 Contents

• 제출문 ...1
• 과제 요약서(초록) ...2
• 목차 ...4
• 그림목차 ...7
• 표목차 ...9
• 제1장. 서론 ...10
• 제1절. 기술개발의 중요성 ...10
• 1. 기술개발 추진배경 ...10
• 가. 단클론항체 ...10
• 나. 단클론항체 친화성 리간드 Protein A의 이용 ...10
• 다. Protein A 제조 및 상용화연구의 중요성 ...11
• 라. 국내외 관련기술 현황 및 시장규모 ...12
• 2. 기술개발 기대효과 ...14
• 3. 기술개발목표 및 평가방법 ...14
• 제2장. 연구내용 및 결과 ...16
• 제1절. 발현계의 재구축 ...16
• 1. 발현계의 재구축 ...16
• 가. 재조합 대장균 개발 ...16
• (1). Protein A 유전자 Cloning ...16
• (2). 발현 벡터의 제조 ...17
• (3). 융합단백질의 발현 ...17
• 나. Protein A발현 균주의 selection ...18
• (1) SP FF를 이용한 Protein A의 1차 정제 ...19
• (2) Q HP를 이용한 Protein A의 polishing ...21
• (3) Target Protein A의 선정 ...22
• 제2절. Protein A 제조공정 최적화 ...24
• 1. 유가식 배양에 의한 고농도 배양특성 연구 ...24
• 2. Protein A-Sac 정제특성 기초 연구 ...26
• 가. SP FF양이온 수지를 이용한 포집 및 융합단백질 절단 ...26
• 나. Q HP음이온 수지를 이용한 2차 정제 ...26
• 3. Protein A-Sac 정제 최적화 연구 ...27
• 가. Heating에 따른 정제 효과 ...27
• 나. pH에 따른 capturing과 polishing 영향 ...29
• (1). SP FF에서 pH가 capturing에 미치는 영향 ...29
• (2). SP 수행 pH에 따른 후속 Q HP polishing 영향 ...30
• 다. Lysis buffer에 detergent의 capturing효과 ...31
• (1). Lysis buffer의 Triton x-100, Triton X-114의 영향 ...31
• 라. 최적 loading량 산출 ...32
• (1). Resin량 대비 loading sample양의 영향 ...32
• (2). Wet cell 양에 따른 SP FF resin의 영향 ...33
• ① Lysis buffer pH 5.5-6.3 실험 ...33
• ② Lysis buffer pH 4.8-5.8 실험 ...34
• ③ Resin대비 sample loading양과 flow rate영향 ...35
• ④ Endotoxin과 impurity 제거를 위한 washing step후 yield 비교 ...36
• 4. Protein A-SAc의 semi scale up 을 통한 공정 검증 ...38
• 가. SP FF 를 이용한 On-column cleavage ...38
• 나. Q HP를 이용한 2차 정제 ...39
• 다. Ultra filtration을 이용한 단백질 농축과 buffer change ...39
• 라. Yield비교 ...40
• 마. SEC chromatography분석 ...40
• 제3절. Proein A 제조공정 scale up ...41
• 1. Protein A-SAc 발효공정 scale up ...41
• 2. Protein A-Sac 정제공정 Scale-up ...42
• 가. 1차 정제(SP FF 5L scale) ...43
• 나. 2차 정제(Q HP 5L scale) ...44
• 다. SEC chromatography분석 ...44
• 라. Scale-up yield비교 ...45
• 제4절. 분석법 개발 및 제조제품 QC ...46
• 가. SDS-PAGE분석 ...46
• 나. Size exclusion chromatography ...46
• 다. Reverse phase chromatography (related protein) ...47
• 라. Endotoxin test ...47
• 마. Protein content ...48
• 바. Triton X-114 test ...48
• 사. Bio-burden test ...48
• 제5절 Master Cell Bank의 제조 ...49
• 1. MCB 제작 기준 및 Guideline ...49
• 가. Guideline ...49
• 나. MCB System ...49
• 다. Storage System ...49
• 라. Characterization과 정기적 시험 항목의 설정 ...49
• 2. MCB 구축 procedure ...50
• 가. Cell Banking History ...50
• (1) 균주의 안정성 ...50
• (2) Cell Banking History ...50
• 나. MCB 제작 Procedure ...50
• (1). Characterization과 정기적 시험 ...50
• (2). 설정한 허용 기준 ...50
• (3). 실험결과 ...51
• (가). 10세대 및 100세대 배양 ...51
• (나) 삽입된 플라스미드의 복제수 결정 ...51
• (다) Plasmid Restriction Map ...52
• (라) Viabliity는 초기 대비 50% 이상을 유지 ...53
• (마) 항생제 내성 시험 ...54
• (바) rProteinASAc의 발현율 ...54
• (사) 삽입된 rProteinASAc 유전자의 DNA 서열확인 ...55
• (아) 플라스미드 bearing & non-bearing ...55
• (자) Other microorganism contamination ...55
• 3. MCB System ...57
• 가. Banking System ...57
• 나. MCB Storage System ...57
• 제6절. Protein A-SAc characterization ...58
• 1. SEC column을 이용한 protein A의 순도 분석 ...58
• 가. 실험방법 ...58
• 나. 실험결과 ...58
• 2. IgG column binding test ...59
• 가. 실험방법 ...59
• 나. 실험결과 ...59
• 3. Protein A의 amino acid analysis ...60
• 가. 실험방법 ...60
• 나. 실험 결과 ...60
• 4. Protein A의 IEF ...61
• 가. 실험방법 ...61
• 나. 실험결과 ...61
• 5. N-terminal sequence ...62
• 6. MALDI-TOF를 이용한 질량분석 ...63
• 7. Protein chip을 이용한 binding assay ...64
• 가. 실험방법 ...64
• 나. 실험결과 ...64
• 제7절. 문서화 ...65
• 제8절. 참고문헌 ...66