초록 ▼

난배양성 미생물을 배양하기 위한 배양방법은 극히 제한적이며 대다수가 평판배지법에 국한되고 있어 새로운 배양방법의 개발이 절실히 필요하다. 또한 국내 해양환경 및 갯벌환경에서 표층 빈영양 미생물 밀 무척추동물 공생 원핵미생물을 배양하는 시도 또한 극히 제한되었음. 본 연구과제는 이러한 배경을 바탕으로 다음과 같은 연구목적을 설정하였다.
1) 한국적 실정에 맞는 반자동, 저비용, 고효율 다량배양기법 개발
2) 해수 유래 빈영양 난배양 미생물의 배양 및 확보
3) 해양무척추동물 공생 난배양 미생물의 배양 및 확보
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난배양성 미생물을 배양하기 위한 배양방법은 극히 제한적이며 대다수가 평판배지법에 국한되고 있어 새로운 배양방법의 개발이 절실히 필요하다. 또한 국내 해양환경 및 갯벌환경에서 표층 빈영양 미생물 밀 무척추동물 공생 원핵미생물을 배양하는 시도 또한 극히 제한되었음. 본 연구과제는 이러한 배경을 바탕으로 다음과 같은 연구목적을 설정하였다.
1) 한국적 실정에 맞는 반자동, 저비용, 고효율 다량배양기법 개발
2) 해수 유래 빈영양 난배양 미생물의 배양 및 확보
3) 해양무척추동물 공생 난배양 미생물의 배양 및 확보
4) 배양된 신분류군의 국제적인 등록, 공인, 그리고 균주의 기탁
본 연구는 3년 동안 희석-소멸법을 이용한 저가형 난배양성 미생물의 고효율 배양기법의 개발과 이를 이용한 해수 및 해양무척추동물에서의 난배양성 미생물의 분리와 확보를 주된 범위로 하고 있다. 각 연차의 핵심 연구내용은 다음과 같다.
1년차 : 희석-소멸법을 이용한 해양 빈영양 난배양성 세균의 분리 및 배양
2년차 : 해수 및 해양무척추동물에서 난배양성 해양미생물의 분리
3년차 : 해수 및 해양무척추동물과 상호작용하는 미생물의 확보 및 다상분류를 통한 신종의 국제적 등록

Abstract ▼

There have been very limited number of researches to cultivate noncultured marine microbes. As a result, very few research methodologies have been applied to the field of cultivation of uncultured marine prokaryotes. Because almost every kinds of cultivation efforts have used conventional culturing

There have been very limited number of researches to cultivate noncultured marine microbes. As a result, very few research methodologies have been applied to the field of cultivation of uncultured marine prokaryotes. Because almost every kinds of cultivation efforts have used conventional culturing methods, so-called spread plating methods, there is an urgent need to develop new cultivation methods. Considering the above factors, the following research objectives have been set-up.
1) To develop a cost-effective, semi-automated, and high throughput cultivation method.
2) To isolate oligotrophic and uncultured marine microorganisms
3) To cultivate marine invertebrate-associated uncultured prokaryotes
4) To register official nomenclatures on the newly isolated novel taxa through polyphasic taxonomy and deposit the cultures in the international culture collections.

목차 Contents

• 표지...1
• 제출문...2
• 요약문...3
• SUMMARY...5
• CONTENTS...7
• 목차...9
• 제1장 연구개발과제의 개요 ...19
• 제1절 연구개발의 목적 ...19
• 제2절 연구개발의 필요성 및 범위 ...21
• 1. 기술적 측면 ...21
• 2. 생태？환경？사회？문화적 측면 ...23
• 3. 연구의 범위 ...24
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ...27
• 제1절 국내외 연구개발 현황 ...27
• 제2절 난배양성 미생물 배양기술의 현황 ...28
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ...31
• 제1절 해수환경에서 난배양 미생물 고효율배양 ...31
• 1. 미생물 고효율배양 연구 방법 ...31
• 가. 연구지역 및 시료채취 ...31
• 나. 일반 평반배지를 이용한 미생물의 배양 ...31
• 다. 희석.소멸법에 기초한 고효율 배양기법을 통한 미생물의 분리 ...34
• (1) 해수기반 배양배지의 제작 ...34
• (2) 희석-소멸법에 의한 해수의 희석 및 접종, 배양 ...34
• (3) 형광현미경 관찰을 위한 slide의 제작과 형광현미경 탐색 ...34
• (4) 배양액의 회수와 순수배양을 통한 분리 ...35
• 라. 16S rDNA를 이용한 미생물의 계통학적 분석 ...37
• (1) Genomic DNA의 추출 ...37
• (2) 16S rDNA 증폭과 정제 ...37
• (3) 제한효소 절편 다형성 분석 (restriction fragment length polymorphism; RFLP) ...39
• (4) 16S rDNA 염기서열 분석 및 계통도 작성 ...39
• 마. 배양된 해양 Gammaproteobacteria의 생장 특성 분석 ...41
• 2. 해수미생물 배양 결과 ...44
• 가. 저가형 고효율배양기법 확립 및 해양빈영양 미생물의 배양 ...44
• (1) 희석-소멸법의 개요 ...44
• (2) 희석-소멸법의 확립 ...45
• (3) 용존 탄소 농도에 따른 고효율 배양기법의 배양성 비교 ...49
• (4) 희석？소멸을 통한 배양액에서의 콜로니 형성 여부 ...52
• (5) 미세콜로니(Micro-colony)의 관찰 ...55
• (6) 콜로니 형성 균주의 16S rDNA 염기서열 및 계통학적 분석 ...57
• (7) 배양된 해양 Gammaproteobacteria의 생장 특성 ...63
• (가) 대표 균주의 선정 ...63
• (나) 선정 균주의 생장 특성 ...65
• (다) 선정 균주의 비특이적 생장률(μ)의 차이 ...68
• (라) 선정 균주의 생장곡선 ...72
• 나. 배양된 미생물의 다양성 및 균주의 기탁 ...76
• (1) 총 배양된 미생물의 수, 신종 후보의 수, 균주의 기탁 ...76
• (2) 배양된 미생물의 분자계통학적 다양성 ...92
• 제2절 해양무척추동물 및 갯벌에서 미생물 분리 ...98
• 1. 연구 배경 ...98
• 2. 연구 방법 ...100
• 가. 시료의 채취 및 운반 ...100
• 나. 해양무척추동물 공생 미생물 및 갯벌퇴적물에서의 미생물 분리 ...102
• 다. 분자계통학적 분석 ...104
• (1) 핵산의 추출 ...104
• (2) 16S rRNA 증폭 ...104
• (3) 제한효소 절편 길이 다형성(RFLP) ...105
• (4) 염기서열 분석 및 계통학적 분석 ...105
• 3. 연구 결과 및 고찰 ...106
• 가. 배양가능 세균군집의 분석 ...106
• (1) 배양 및 분리된 균주의 수 ...106
• (2) 16S rDNA 염기서열의 유사도 분석 ...108
• (3) 16S rDNA에 기초한 분자계통학적 분석 ...108
• (가) 갯지렁이 소화관에서 분리된 세균 ...108
• (나) 갯벌 퇴적물에서 분리된 세균 ...116
• (다) 갯지렁이 소화관 및 갯벌 퇴적물의 배양가능 세균군집 비교 ...122
• 제3절 배양균주의 다상분류 ...135
• 1. 연구배경 ...135
• 2. 연구방법 ...136
• 가. 신분류군의 다상분류 ...136
• (1) 분자유전학적 분석 ...136
• (2) 형태-표현형질에 따른 분석 ...137
• (가) 세포 형태 관찰 ...137
• (나) 물리적 성장 요인에 따른 배양상태 관찰 ...137
• (다) 생리-생화학적 특징 및 세포 구성물질 분석 ...137
• 3. 완료된 다상분류 (투고 혹은 투고예정) ...144
• 가. 해양 빈영양성 Gammaproteobacteria의 다상분류 ...144
• (1) 형태 및 기본 생리 특성 ...144
• (가) 미생물의 형태 관찰 ...144
• (나) 물리적 성장요인에 따른 배양 관찰 ...145
• (다) 기본 생리 특성 관찰 ...149
• (2) 생화학적 특성 ...153
• (3) 계통학적 분석 ...153
• (가) IMCC2047 균주의 계통학적 분석 ...154
• (나) IMCC2115 균주의 계통학적 분석 ...156
• (다) IMCC2136 균주의 계통학적 분석 ...158
• 4. 다상분류를 통해 공식 등록된 미생물 ...160
• 가. IMCC1616의 다상분류; Lutimonas vermicola gen. nov., sp. nov. ...160
• 나. 그 외 공식 등록된 미생물의 종합적인 고찰 ...166
• (1) IMCC1914; Gaetbulibacter marinus sp. nov. ...166
• (2) IMCC1877; Marinobacterium litorale sp. nov. ...170
• (3) IMCC1545; Puniceicoccus vermicola sp. nov. ...174
• (4) IMCC1001; Sufflavibacter maritimus sp. nov. ...177
• (5) HTCC2601; Pelagibaca bermudensis sp. nov. ...181
• (6) IMCC2654; Maritimibacter gen. nov., sp. nov. ...185
• (7) IMCC2662, IMCC2663; Ruegeria pelagia sp. nov. ...189
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ...193
• 제1절 연구목표 및 연구내용 ...193
• 1. 연구개발의 최종목표 : ...193
• 2. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ...193
• 제2절 연구목표 및 평가착안점에 근거한 목표 달성도 ...194
• 제3절 연구개발성과 현황 ...197
• 1. 종합 성과물 목록 ...197
• 2. 연구논문 발간 현황 ...197
• 3. 학술회의 발표실적 ...199
• 제5장 연구개발결과의 활용계획 ...203
• 제1절 연구개발결과의 대표적 성공사례 ...203
• 1. 연구개발성과의 질적 우수성 ...203
• 2. 대표적 연구개발성과 ...204
• 가. 해수 서식 미생물 및 해양무척추동물과 상호작용하는 미생물의 희석-소멸법을 이용한 성공적 확보 ...204
• 나. 갯지렁이의 소화관에서 해양세균 중 최초로 Verrucomicrobia 문에 속하는 세균 분리 및 새로운 목(order)의 등록 ...204
• 다. SAR116, RCA cluster, OM75, CHABIII-7 등 비배양 해양군집에 속하는 미생물의 최초 배양 및 광생산 기작의 탐색 ...205
• 라. 갯지렁이 소화관 및 해양에서 신 분류군의 국제적인 등록 및 논문 발간 ...206
• 마. 해양에서 빈영양성 콜로니 생성세균의 계통학적 추적 및 생리적 연구 ...206
• 제2절 연구개발결과의 활용계획 ...207
• 1. 연구개발성과의 응용잠재력 및 사업화시의 활용가능성 ...207
• 가. 기술적 응용잠재력 ...207
• 나. 사업화로서의 활용가능성 ...207
• 다. 연구개발성과의 산업？공공분야 파급효과 ...208
• (1) 산업분야 ...208
• (2) 공공분야 ...208
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ...209
• 제7장 참고문헌 ...211