[보고서]염수환경에서 저밀도생장 절대빈영양 미생물의 고효율 배양

조장천

[국가R&D연구보고서] 염수환경에서 저밀도생장 절대빈영양 미생물의 고효율 배양
High Throughput Cultivation of Obligately Oligotrophic Marine Prokaryotes Growing in Low Densities 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	인하대학교 InHa University
연구책임자	조장천
참여연구자	오현명 , 이기영 , 양승조 , 송재호 , 임승일 , 이광현 , 최아영
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2012-05
과제시작연도	2011
주관부처	교육과학기술부
과제관리전문기관	한국연구재단 National Research Foundation of Korea
등록번호	TRKO201200007265
과제고유번호	1345162412
사업명	21세기프론티어연구개발
DB 구축일자	2013-04-18
키워드	염수환경.빈영양 미생물.희석-소멸.고효율배양.다상분류.saline environment.oligotrophic microbe.high throughput culturing.dilution-to-extinction.polyphasic taxonomy.

초록 ▼

본 연구에서 4년 동안 희석-소멸법을 이용한 저밀도생장 절대빈영양 미생물의 탐색 및 확보를 위해 다양한 배양조건 및 다양한 염구환경에서 개선된 High-throughput culturing (HTC)의 수행을 주된 연구개발의 내용으로 하고 있다. 각 연차의 핵심 연구내용은 다음과 같다.
1년차: 저밀도생장 빈영양미생물 탐색을 위한 희석-소멸 고효율배양기법(HTC)의 개량
2년차: 다양한 배양조건에서 개선된 HTC의 수행을 통한 미생물의 분리
3년차: 다양한 염수환경(연안, 외양, 염전 등)에서 HTC 수행 및 절대빈

Abstract ▼

During four-year of the research period, this research have focused on the improvement of high throughput cultivation method based on dilution-to-extinction for cultivating obligately oligotrophic marine bacteria, molecular identification of the isolates, and polyphasic taxonomy on the newly isolated novel taxa.
First year : Improvement of high throughput culturing based on dilution-to-extinction for low-density growing bacteria
Second year: Isolation of marine microbes using improved high throughput culturing method in various culture conditions
Third year: Isolation of marine microbes using the improved high throughput culturing method from saline environment samples
Fourth year: Analysis of cultured bacterial diversity and genome data together with official registration of novel marine isolates

목차 Contents

표지 ... 1
제출문 ... 2
보고서 요약서 ... 3
요약문 ... 4
SUMMARY ... 6
목차 ... 11
제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 20
제 1 절 연구개발의 목적 ... 20
제 2 절 연구개발의 필요성 및 범위 ... 22
1. 기술적 측면 ... 22
2. 생태·환경·사회·문화적 측면 ... 24
3. 연구의 범위 ... 26
제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 29
제 1 절 국내외 연구개발 현황 ... 29
제 2 절 난배양성 미생물 배양기술의 현황 ... 30
제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 33
제 1 절 저밀도 생장 해양 난배양미생물 배양기법 개선 ... 33
1. 저온, 장기배양을 통한 해양 우점종의 배양 ... 33
가. 연구개요 및 연구방법 ... 33
나. 연구결과 ... 34
2. 전체 유전체 증폭(whole genome amplification)을 통한 균주 배양 ... 38
가. 연구개요 및 연구방법 ... 38
나. 연구결과 ... 40
3. Mini Flow Cytometry를 이용한 저밀도 생장 미생물 확인 ... 42
가. 연구개요 및 연구방법 ... 42
나. 연구결과 ... 44
제 2 절 다양한 배양조건에서 개선된 희석-소멸법 적용 ... 45
1. 연구개요 및 연구방법 ... 45
2. 연구결과 ... 48
제 3 절 희석-소멸 배양 및 세균군집구조의 월별 분석 ... 52
1. 동해 연안에서 희석-소멸 배양 및 군집구조의 월별 분석 ... 52
2. Marine Verrucomicrobia의 대규모 배양 및 생리적 특징 분석 ... 62
가. 연구개요 및 연구방법 ... 62
나. 연구결과 ... 62
(1)지방산 분석 결과 ... 69
(2)인지질 분석 결과 ... 69
(3) 종합적인 생리적 특징 ... 69
제 4 절 단일시료-대규모 접종에 의한 희석-소멸 배양 ... 73
1. 연구개요 및 연구방법 ... 73
2. 연구 결과 ... 73
가. 동해시료에서 대량의 HTC 실험결과 ... 73
나. 배양된 균주들의 분자계통학적 분석 ... 75
다. 비배양방법인 pyrosequencing 분석 결과 ... 81
제 5 절 배양균주의 다상분류 ... 86
1. 연구개요 및 연구방법 ... 86
2. 다상분류를 통해 공식 등록된 미생물의 고찰 ... 86
가. IMCC3223; Lewinella antarctica sp. nov. ... 87
나. IMCC2115; Porticoccus litoralis gen. nov., sp. nov. ... 89
다. IMCC2782; Litoricola marina sp. nov. ... 91
라. IMCC4489 and IMCC4451; Reinekea aestuarii sp. nov. ... 93
마. IMCC4453; Saccharospirillum aestuarii sp. nov. ... 95
바. IMCC1412; Kordia periserrulae sp. nov. ... 97
제 6 절. 유전체 염기서열 분석, 등록, 논문발간 ... 99
1. Genome sequence of Erythrobacter litoralis HTCC2594 ... 101
2. Genome sequence of Robiginitalea biformata HTCC2501 ... 104
3. Genome sequence of Croceibacter atlanticus HTCC2559 ... 107
4. Genome sequence of Parvularcula bermudensis HTCC2503 ... 110
5. Genome sequence of Maribacter sp. HTCC2170 ... 113
6. Genome sequence of Rhodobacterales sp. HTCC2083 ... 116
7. Genome sequence of marine gammaproteobacterium HTCC2143 ... 119
8. Genome sequence of Candidatus Puniceispirillum marinum IMCC1322 ... 122
9. Genome sequence of gammaproteobacterium IMCC1989 ... 125
10. Genome sequence of gammaproteobacterium IMCC2047 ... 127
11. Genome sequence of gammaproteobacterium IMCC3088 ... 129
12. Genome Sequence of Lentisphaera araneosa HTCC2155 ... 131
13. Genome sequence of Fulvimarina pelagi HTCC2506 ... 133
14. Genome sequence of the marine alphaproteobacterium HTCC2150 ... 135
15. Genome Sequence of Oceanicaulis sp. Strain HTCC2633 ... 137
제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 139
제 1절 연구목표 및 연구내용 ... 139
1. 연구개발의 최종목표 ... 139
2. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 140
제 2절 연구목표 및 평가착안점에 근거한 목표 달성도 ... 141
제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 143
1. 기술적 측면 ... 143
2. 경제산업적 측면 ... 143
3. 활용 계획 ... 143
제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 145
제 7 장 연구시설·장비 현황 ... 146
제 8 장 참고문헌 ... 147

표/그림 (81)

표 Purpose of this study throughout the research period.
표 Fig. 1-2-1. Schematic diagram of this research.
표 Research scope and specific contents of research and
표 Summary of dilution-to-extinction culturing results.
표 Taxonomic affiliations of extinction cultures based on RFLP and 16S rRNA
표 Fig. 3-1-1. Neighbor-joining phylogenetic tree, based on 16S rRNA gene sequences, showing the relationships between isolates cultured from the East Sea, the Western Pacific Ocean and representatives of the SAR11 clade of the Alphaproteobacteria
표 Fig. 3-1-2. Neighbor-joining phylogenetic tree, based on 16S rRNA gene sequences, showing the relationships between the isolates cultured from the East Sea, Western Pacific Ocean and representatives of the Alpha-, Beta-, Gammaproteobacteria, and Firmicutes.
표 Fig. 3-1-3. Isolation and identification of dilution cultures by the combined methods of HTC and whole genome amplification.
표 Fig. 3-1-4. Restriction pattern analyses after whole genome amplification and 16S rRNA gene PCR.
표 Fig. 3-1-5. Phylogenetic analyses of 16S rRNA gene sequences of IMCC9062 and IMCC9063 belonging to the SAR11 group 3.
표 Fig. 3-1-6. Application of Guava Mini Flow Cytometry to detect extinction cultures.
표 Fig. 3-1-7. Comparison of detection efficiency for extinction cultures by using epifluorescnce microscopy and Guava Mini Flow cytometry.
표 Fig. 3-2-1. A geographic map of sampling sites.
표 Different culture conditions for HTC experiment.
표 Fig. 3-2-2. The categorization of demarcating novel bacterial genera and species.
표 Summary of HTC experiment from the Yellow Sea and the East
표 Number of novel genus and species candidates from the HTC
표 Fig. 3-2-3. Phylogenetic analyses of 16S rRNA gene sequences retrieved from HTC isolates.
표 Various culture conditions for high throughput culturing by months in 2009.
표 Summary of monthly HTC results in 2009.
표 Phylogenetic assignment of HTC isolates.
표 Fig. 3-3-1. Composition of HTC isolates assigned to the major phyla.
표 Fig. 3-3-2. Phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequences of IMCC isolates assigned to the Alphaproteobacteria
표 Fig. 3-3-3. Phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequences of IMCC isolates assigned to the Gammaproteobacteria.
표 Fig. 3-3-4. Bacterial community structure examined by 16S rRNA tag sequencing
표 Phylogenetic assignment of tagged sequences to the major bacterial clusters.
표 Numbers of IMCC isolates in the Verrucomicrovia group cultivated by
표 Fig. 3-3-5. Neighbour-joining phylogenetic tree, based on 16S rRNA gene sequences, showing the relationship between IMCC group and phylum Verrucomicrobia.
표 Fig. 3-3-6. Based on 16S rRNA gene phylogeny, cultured IMCC strains divided into 4 groups(MVG ; Marine Verrucomicrobia Group). Red color is colony forming strains.
표 Fig. 3-3-7. Summary of specific growth rate by carbon concentration
표 Fig. 3-3-8. Summary of specific growth rate by temperature
표 Celluar fatty acid composition (%) of IMCC stains.
표 Fig 3-3-9. Two-dimensional thin-layer chromatograms of total polar lipids extracted from strains IMCC11284, IMCC11262, IMCC11245, IMCC8834.
표 High-throughput culturing condition setup.
표 Results of HTC and colony forming experiments.
표 Phylogenetic distribution of 16S rRNA gene sequencing of isolates.
표 Fig. 3-4-1. Phylogenetic tree that show relationships between IMCC isolates and related members of the Alphaproteobacteria
표 Fig. 3-4-2. Phylogenetic tree that show relationships between IMCC isolates and related members of the Betaproteobacteria.
표 Fig. 3-4-3. Phylogenetic tree that show relationships between IMCC isolates and related members of the Gammaproteobacteria
표 Fig. 3-4-4. Phylogenetic tree that show relationships between IMCC isolates and related members of the Verrucomicrobia
표 Bacterial community abundance in pyrosequencing
표 Fig. 3-4-5. Bacterial community structure in pyrosequencing results from HTC isolates and East Sea seawater
표 Bacterial community abundance in pyrosequencing results from HTC
표 Fig. 3-4-6. Bacterial community structure in pyrosequencing results from HTC isolates and East Sea seawater
표 Fig. 3-5-1. Maximum likelihood phylogenetic tree, based on 16S rRNA gene sequences, showing the relationships between strain IMCC3223T and representatives of the phylum Bacteroidetes.
표 Fig. 3-5-2. Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences, showing the relationships between strain IMCC2115T and representatives of the related taxa.
표 Fig. 3-5-3. Neighbour-joining phylogenetic tree, based on 16S rDNA sequences, showing the relationship between strain IMCC2782T and its relatives of the order Oceanospirillales.
표 Differential characteristics between strains L. marinaT T
표 Fig. 3-5-4. Neighbour-joining phylogenetic tree, based on 16S rRNA sequences, showing the relationship between strains IMCC4489T and IMCC4451 and their relatives in the order Oceanospirillales.
표 Fig. 3-5-5. Neighbour-joining phylogenetic tree, based on 16S rRNA gene sequences, showing the relationship between strain IMCC4453T and its neighbours in the order Oceanospirillales.
표 Fig. 3-5-6. Neighbour-joining phylogenetic tree, based on 16S rRNA gene sequences, showing the relationship between strain IMCC1412T and its relatives of the family Flavobacteriaceae.
표 Genome statistics of Erythrobacter litoralis HTCC2594.
표 Fig. 3-6-1. Genomic map of Erythrobacter litoralis HTCC2594
표 Genome statistics of Robiginitalea biformata HTCC2501.
표 Fig. 3-6-2. Genomic map of Robiginitalea biformata HTCC2501
표 Genome statistics of Croceibacter atlanticus HTCC2559.
표 Fig. 3-6-3. Genomic map of Croceibacter atlanticus HTCC2559.
표 Genome statistics of Parvularcula bermudensis HTCC2503.
표 Fig. 3-6-4. Genomic map of Parvularcula bermudensis HTCC2503.
표 Genome statistics of Maribacter sp. HTCC2170.
표 Fig. 3-6-5. Genomic map of Maribacter sp. HTCC2170.
표 Genome statistics of Rhodobacterales sp. HTCC2083.
표 Fig. 3-6-6. RAST subsystem distribution of ORFs annotated in the genome sequence of Rhodobacterales sp. HTCC2083.
표 Genome statistics of HTCC2143.
표 Fig. 3-6-7. RAST subsystem distribution of ORFs annotated in the genome sequence of HTCC2143.
표 Genome statistics of Candidatus Puniceispirillum marinum
표 Fig. 3-6-8. Genomic map of Candidatus Puniceispirillum marinum IMCC1322.
표 Genome statistics of strain IMCC1989.
표 Fig. 3-6-9. RAST subsystem distribution of ORFs annotated in the genome sequence of strain IMCC1989
표 Genome statistics of strain IMCC2047.
표 Fig. 3-6-10. RAST subsystem distribution of ORFs annotated in the genome sequence of strain IMCC2047
표 Genome statistics of strain IMCC3088.
표 Fig. 3-6-11. RAST subsystem distribution of ORFs annotated in the genome sequence of strain IMCC3088.
표 Genome statistics of Lentisphaera araneosa HTCC2155.
표 Fig. 3-6-12. Genomic maps of two longest contigs of HTCC2155
표 Genome statistics of Fulvimarina pelagi HTCC2506.
표 Fig. 3-6-13. Genomic maps of two longest contigs of Fulvimarina pelagi HTCC2506.
표 Genome statistics of HTCC2150.
표 Fig. 3-6-14. Genomic maps of two longest contigs of HTCC2150.
표 Genome statistics of strain HTCC2633.
표 Fig. 3-6-15. Genomic maps of two longest contigs of strain HTCC2633.

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