초록 ▼

분양받은 인간배아줄기세포 Miz-hES1의 배양법을 확립한 후 배아줄기세포의 특성을 확인하였다. 이 배아줄기세포를 collagenase를 이용한 효소적 방법으로 대량 배양하여 생쥐에 면역 주사하여 인간배아줄기세포에 특이적으로 결합하고 생쥐배아섬유아세포 및 생쥐배아줄기세포에는 결합하지 않는 일단의 생쥐 단일클론항체 군을 제조하였다. 이들 중 인간 배아줄기세포 Miz-hES1에 결합하는 34종의 단일클론항체를 최종 확보하고 그중 13종은 또 다른 배아줄기세포인 HSF6에도 결합함을 밝혔다. 이중 항체 20-202S는 약 70-kDa h

분양받은 인간배아줄기세포 Miz-hES1의 배양법을 확립한 후 배아줄기세포의 특성을 확인하였다. 이 배아줄기세포를 collagenase를 이용한 효소적 방법으로 대량 배양하여 생쥐에 면역 주사하여 인간배아줄기세포에 특이적으로 결합하고 생쥐배아섬유아세포 및 생쥐배아줄기세포에는 결합하지 않는 일단의 생쥐 단일클론항체 군을 제조하였다. 이들 중 인간 배아줄기세포 Miz-hES1에 결합하는 34종의 단일클론항체를 최종 확보하고 그중 13종은 또 다른 배아줄기세포인 HSF6에도 결합함을 밝혔다. 이중 항체 20-202S는 약 70-kDa heat shock protein 70 일종인 HSPA8을 미분화 배아줄기세포 표면에서 인식하였으며, 이 단백질은 인간배아줄기세포의 표면 마커로 알려진 SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA1-81과 동시에 세포표면에서 발현하였다. 또 HSPA8은 embryoid body로 분화 시 다른 줄기세포 마커처럼 down-regulation되었고 retinoic acid로 처리하여 분화를 유도하였을 때도 비슷하게 down-regulation됨을 확인하였다. 그 외에도 약 47-kDa 단백질을 인식하는 항체 47-235S도 20-202S와 비슷한 특성을 가지는 새로운 배아 줄기세포 마커로 사용할 수 있음을 확인하였다. 한편 인간배아줄기세포 Miz-hES1에서 인간 신경 줄기 세포들을 유도하였으며 이세포가 신경줄기세포들의 특징적인 마커들을 발현하고 있음을 확인한 후 생쥐에 주사하여 이들 세포에 특이적으로 결합하는 항체 13종을 제조하였다. 그 중 52-A11는 신경 줄기세포 마커인 Nestin, CD133, NCAM, Vimentin과 동시에 염색되는 것이 확인되었으며, 16주에 사산한 태아의 frontral cortex에서 분리한 인간 신경 줄기세포에도 결합함을 밝혔다. 특히 이 항체는 신경 줄기세포 배양에서 bFGF를 뺀 후 분화를 유도한 세포들에서 neuron 마커인 TuJ1의 발현이 증가하는 동안 점점 감소하는 것으로 나타나 미분화시 발현되나 분화 시 점점 감소하는 신경줄기세포의 마커의 특성을 보여주었다. 이와 같이 항체를 이용한 인간 배아줄기세포, 신경 줄기세포의 표면 표식인자의 발굴은 줄기세포의 분화 기술 개발에 기여 할 뿐 아니라, 이들 세포 표면에 존재하는 표식인자에 대한 항체를 제공하여 세포 치료법 개발 시 발암 위험이 있는 배아줄기세포의 제거나, 신경 줄기/전구체 세포만의 순수분리에 사용할 수 있으므로 난치병 치료를 위한 세포 치료법의 발전에 기여할 것이다.

Abstract ▼

The object of this research is to isolate and characterize cell surface markers specific for human stem cells by using murine monoclonal antibodies. To generate a panel of monoclonal antibodies that bind to human embryonic stem cells (hESCs), we immunized Balb/c mice with Miz-hES1 human embryonic st

The object of this research is to isolate and characterize cell surface markers specific for human stem cells by using murine monoclonal antibodies. To generate a panel of monoclonal antibodies that bind to human embryonic stem cells (hESCs), we immunized Balb/c mice with Miz-hES1 human embryonic stem cells. We have generated 34 murine monoclonal antibodies specific for Miz-hES1 and found that thirteen of them bound to another human embryonic stem cell HSF6 too. Among them, we found that the antibody 20-202S recognizes heat shock protein HSPA8 on the surface of the undifferentiated hESCs by flow cytometry and immunocytochemistry. Multiple-color flow cytometric analysis of Miz-hES1 and HSF6 showed the coexpression of the HSPA8 protein with other hESC markers such as SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, and TRA-1-81. Flow cytometirc and Western blot analyses using various cells showed that MAb 20-202S specifically bound to the HSPA8 protein on the surface of the hESCs, contrary to other anti-HSP70 antibodies examined. Furthermore, the surface expression of the HSPA8 protein on the hESCs was markedly down-regulated upon differentiation. These data indicate that a novel MAb 20-202S recognizes the HSPA8 protein on the surface of hESCs, and suggest that the HSPA8 protein is a putative cell-surface marker for undifferentiated hESCs. We derived human neural progenitors from human embryonic stem cell Miz-hES1, according to the modified method described previously (Zhang et al 2001). The neural progenitor cells formed neurospheres and expressed markers of early developing neural stem/progenitor cells such as nestin, pax6, sox1, and hes5. To derive monoclonal antibodies (MAbs) against the surface antigen of the human neural progenitor cells, we immunized single cell suspension of the human neural progenitors into mice and screened a panel of monoclonal antibodies by flow cytometric analyses. Of these, a MAb 52-A11(IgM, k) bound to the neural progenitor cells derived from the Miz-hES1 and another human embryonic stem cell HSF6. The surface antigen recognized by 52-A11 co-localized with neural stem cell markers Nestin, CD133, Vimentin, and NCAM in immunocytometric analyses. However, it didn't co-localize with an early differentiated neuronal marker TuJ1. Furthermore, the surface antigen recognized by 52-A11 was down-regulated following induction of differentiation, while markers of mature neuron cells were up-regulated. In flow cytometric analyses using a human neuroblastoma cell line, the surface antigen recognized by 52-A11 was different from well-known surface antigens CD133 and NCAM. These results suggest that the surface antigen recognized by 52-A11 is a novel cell surface marker of human neural progenitor cells.

목차 Contents

• 표지...1
• 제출문...2
• 보고서 초록...3
• 요약문...4
• SUMMARY...8
• CONTENTS...10
• 목차...12
• I. 서론 ...14
• II. 국내외 기술개발 현황 ...19
• III. 연구개발 수행 내용 및 결과 ...21
• 1. 실험방법 ...21
• 1) 인간배아줄기세포의 배양 ...21
• 2) 인간 신경줄기/전구체 세포의 유도 ...21
• 3) Hematoxylin과 Eosine염색 ...22
• 4) Alkaline phosphatase assay ...22
• 5) SSEA 염색 ...22
• 6) Telomerase 활성 측정 ...23
• 7) Oct-4 발현조사 ...23
• 8) Hybridoma 제조 ...23
• 9) 인간 배아줄기세포에 결합하는 단일클론항체의 제조 ...24
• 10) 단일클론항체의 정제 ...24
• 11) 단일클론항체의 결합특이성 분석 ...25
• 12) 분화 및 미분화된 인간 배아줄기세포에 대한 특이성 ...25
• 13) 인간배아줄기세포에 대한 항체특이성 ...25
• 14) 단일클론항체가 인식하는 항원의 분리 ...25
• 15) 단일클론항체의 결합특이성비교 ...26
• 16) 생쥐에 인간신경줄기/전구체 세포의 면역주사 ...27
• 17) 인간신경줄기세포/전구체 세포에 결합하는 단일클론항체의 제조 ...27
• 18) 다른 신경줄기세포/전구체 세포에 대한 반응성 ...27
• 2. 연구결과 ...28
• A. 항체를 이용한 미분화/전분화능 인간 배아줄기세포 표면 마커 발굴 ...28
• 1) 인간배아줄기세포의 배양 및 특성분석 ...28
• 2) 미분화 인간배아줄기세포를 인식하는 34종의 생쥐 단일클론항체 제조 ...28
• 3) 항체 20-202S, 3-4B, 47-235S는 72, 26, 47kD 단백질을 면역침강 ...31
• 4) 항체 20-202S는 HSPA8 단백질을 인식함 ...31
• 5) 항체 20-202S는 세포표면에서 ATP 존재시 HSPA8 단백질을 인식하지 못함 ...31
• 6) HSPA8는 다양한 인간배아줄기세포 표면에서 발현함 ...34
• 7) 항체 20-202S는 인간배아줄기세포에 다른 알려진 마커들과 동시 염색됨 ...34
• 8) HSPA8은 분화유도시 인간 배아줄기세포 표면에서 downregulation ...34
• 9)항체 20-202S로 MEF에서 HSPA8의 발현 비교 ...39
• 10) Human Embryonal carcinoma cell line NTERA2와 비교 분석 ...39
• 11)항체 3-4B, 47-235S항원도 분화 유도된 인간배아줄기세포에서 down-regulation됨 ...46
• B. 항체를 이용한 인간 신경줄기/전구체 표면 마커 발굴 ...48
• 1) 인간배아줄기세포표면에서 인간 신경줄기세포/전구체 세포의 유도 ...48
• 2) hNP1에특이적인 생쥐 단일클론항체 13종의 제조 ...53
• 3) 항체 52-A11의 인간 신경줄기세포와 다양한 세포에서의 결합능 측정 ...57
• 4) 항체 52-A11과 신경 줄기 세포마커와의 동시염색 분석 ...61
• IV. 목표달성도 및 관련 분야에서의 기여도 ...67
• V. 연구개발과제의 활용계획 ...71
• VI. 연구개발과정에서 수집한 해외 과학기술정보 ...72
• VII. 참고문헌 ...73