초록 ▼

●본 연구는 단클론항체 의약품의 전임상 약리 평가를 위한 모델 개발과 효력 등 약리시험 평가 지표 확립을 위해 유전자 재조합 기술을 도입하여 특정 단클론항체(TNF-alpha)에 의해 형광단백질 (Green fluorescence protein) 및 luciferase 단백질의 발현이 조절되는 형질전환 연골세포주의 구축 및 동물을 이용한 관절염 유도 모델을 구축하여 TNF-alpha에 대한 단클론항체 의약품의 전임상 약리 평가를 위한 최적의 biomarker 발굴을 위한 실험모델을 확립하고자 하였다.
●단클론항체 의약품의 효력

●본 연구는 단클론항체 의약품의 전임상 약리 평가를 위한 모델 개발과 효력 등 약리시험 평가 지표 확립을 위해 유전자 재조합 기술을 도입하여 특정 단클론항체(TNF-alpha)에 의해 형광단백질 (Green fluorescence protein) 및 luciferase 단백질의 발현이 조절되는 형질전환 연골세포주의 구축 및 동물을 이용한 관절염 유도 모델을 구축하여 TNF-alpha에 대한 단클론항체 의약품의 전임상 약리 평가를 위한 최적의 biomarker 발굴을 위한 실험모델을 확립하고자 하였다.
●단클론항체 의약품의 효력평가를 위한 목표인자 선택: 인간화 항체를 기준으로 임상에서 그 응용범위가 넓고 거부 반응이 가장 적은 TNF-alpha 대한 단클론항체 의약품을 선발하였다.
●TNF-alpha에 의해 녹색현광단백질(GFP)및 luciferase 단백질의 발현이 조절되는 lentiviral reporter plasmid 제작: TNF alpha에 의해 조절되는 NF-kB GFP와 NF-kB LUC plasmid을 제작하였다.
●형질전환 연골세포주의 개발: TNF-alpha 및 단클론항체의 약리활성을 정량하는 형질전환 연골세포주 2종의 제작 및 최소 2종이상의 단클론항체 효력평가를 통한 전임상약리 세포 실험계를 확립하였다.
●형질전환 연골세포주의 발현검증: 확립된 형질전환 연골세포주에서 TNF-alpha에 의한 GFP 및 luciferase 단백질 발현 검증: western blot analysis, 형광발색 Fluorometer 및 luciferase activity assay 법을 이용하여 형질전환 세포주의 발현을 검증하였다.
●형질전환 연골세포주를 이용한 단클론항체 의약품의 효력평가: 형질전환 세포주를 이용한 TNF-alpha 단클론항체의 효력을 평가하기 위하여 두 종의 항체를 사용하였다. TNF aplpha 에 대한 단일항체의 민감도 평가를 위한 최저 유의적 저해 농도는 0.1 ug/ml 이며, 5 ug/ml의 농도 이상에서는 완벽하게 저해함을 확인하였다. 형질전환 세포주에서 단클론항체에 의한 IL-1beta, COX-2 발현 및 PGE2 생성은 TNF alpha에 의해서 증가된 COX-2 와 IL-beta 의 mRNA 발현 및 $PGE_2$ 생성이 TNF alpha 단클론항체에 의해서 억제되었다.
● TNF-alpha에 대한 단클론항체 의약품의 효력평가를 위한 관절염 유도동물 모델 구축: 콜라겐 유도 모델 쥐를 이용하여 최소 2종 이상의 단클론항체 효력평가를 통한 전임상약리 동물 실험계를 확립하였다. 양성 대조군 쥐와 단클론항체를 투여한 쥐의 부종의 크기 및 관절 부위 손상정도를 비교하면 저농도 (10ug)의 TNF alpha 단클론항체를 투여한 그룹은 부종이 크기와 관절부위 염증이 뚜렷하게 줄어들지 않았지만 고농도(30 ug)를 처리 한 그룹에서는 부종의 크기 및 관절부위 염증 정도가 뚜렷하게 감소하였다. 또한 저농도(10 ug)의 TNF alpha 단클론항체를 투여한 그룹은 TNF alpha, IL-1beta, $PGE_2$ 의 발현 및 생성이 뚜렷하게 줄어들지 않았지만 고농도(30 ug)를 처리 한 그룹에서는 TNF alpha, IL-1beta, $PGE_2$ 의 발현 및 생성이 뚜렷하게 감소하였다. 단클론항체 투여시 동물의 뚜렷한 행동약리 변화는 관찰되지 않았으며, 장기이상도 없었다.
●단클론항체의 약동학 연구를 위하여 TNF alpha 단클론항체를 정맥주사후 경시적으로 혈액을 채취하여, 제작된 luciferase-세포주에 혈청을 투여 후 TNF-alpha 형광발현정도를 비교하여 기초 약동학 연구를 수행하였다. 혈중 단클론항체의 농도는 본 연구기법에서도 유의적으로 검출되나 그 감도는 기존에 이용되는 ELISA assay에 비하여 낮았다.
●본 연구에서는 유전자 재조합 기술을 도입하여 특정 단클론항체(TNF-alpha)에 의해 형광단백질 (Green fluorescence protein) 및 luciferase 단백질의 발현이 조절되는 형질전환 연골세포주의 구축하였으며, 동물을 이용한 관절염 유도 모델을 구축하여 TNF-alpha에 대한 단클론항체 의약품의 전임상 약리 평가를 위한 최적의 biomarker 발굴을 위한 실험모델을 확립하였다.

Abstract ▼

●In order to establish new cell lines for the in vitro efficacy test of monoclonal antibodies, we selected monoclonal antibodies against TNF-alpha.
●Construction of rentiviral plasmid containing TNF-alpha-inducible GFP-reporter gene: NF-kB responsive elements were subcloned into the pTRF-mCMV-dsc

●In order to establish new cell lines for the in vitro efficacy test of monoclonal antibodies, we selected monoclonal antibodies against TNF-alpha.
●Construction of rentiviral plasmid containing TNF-alpha-inducible GFP-reporter gene: NF-kB responsive elements were subcloned into the pTRF-mCMV-dscGFP vector (GFP-reporting rentiviral plasmid).
●Construction of rentiviral plasmid containing TNF-alpha-inducible luciferase-reporter gene: NF-kB responsive elements were subcloned into the pTRF-mCMV-dscLuc vector (Luciferase-reporting rentiviral plasmid).
●Establishment of stable cell lines: HTB-94 cells were infected with rentiviral particles (pTRF-mCMV-dscLuc or pTRF-mCMV-dscGFP). The intensity of infection was monitored by GFP-fluorescence or lumenescence after exposure of both the cells to TNF-alpha. Among the established cell lines, reporting sensitivity to TNF-alpha was outstanding in luciferase-reporting HTB-94 cells. Hence, we performed efficacy test of monoclonal antibodies using HTB-94 cells infected with pTRF-mCMV-dscLuc viral particles.
● Pharmacological study for the monoclonal antibody drug monoclonal antibodies using the developed cell lines: To estimate the efficacies of monoclonal antibodies, we used two kinds of monoclonal antibodies in each cell line. TNF-alpha-inducible luciferase reporter activity was completely inhibited by above 5 ug/ml TNF-alpha monoclonal antibody (Chemicon) and the mininal effective concentration is 0.1 ug/ml ($IC_{50}$ + ~0.5 ug/ml). The inhibitory efficacy of AbCam antibody was comparable to that of Chemicon antibody.
● To imitate the clinical scenario of RA, mice were subjected to CIA. CIA developed rapidly in mice immunized with CII and clinical signs of the disease first appeared in hind paws between 21 and 23 days postchallenge leading to a 100% incidence of CIA at day 28. Hind paw erythema and swelling increased in frequency and severity in a timedependent mode with maximum arthritis indices of approximately 10 observed between days 29 and 35 postimmunization in CIA-control mice. TNF alpha antibody treatment demonstrated a significant reduction of joint inflammation, as identified by a significant reduction in the incidence of arthritis. The histological alterations of joint were significantly reduced in TNF alpha antibody treated mice. Treartmnet of TNF alpha antibody did not cause any changes in Behavior pharmamcology parameters.
● We initiated studies to assess the effect of TNF alpha antibody on the expression of chemokines into the inflamed joints during the development of CIA. COX-2 levels in CIA-TNF alpha antibody mice on day 35 were significantly reduced in comparison with vehicle-treated CIA-control mice.
● To test whether TNF alpha antibody modulates the inflammatory process through the regulation of cytokine secretion, we analyzed the plasma levels of TNF-a, IL-1beta and $PGE_2$ Levels of TNF-a, IL-1beta and $PGE_2$ were significantly reduced in CIA-TNF alpha antibody mice in comparison to CIA-control.
● To establish a new pharmacokinetics tool for monoclonal antibody, blood samples were collected from the mice preinjected with mAb. The intensity of luciferase activities were determined in the lysates obtained from the established luciferase-cell lines exposed to the obtained serum. We successfully detected serum concentrations of mAb, but the sensitivity was lower than ELISA assay system.

목차 Contents

• 용역연구사업 연구결과보고서 ...1
• 표지 ...2
• 제출문 ...4
• 목차 ...5
• I. 연구개발결과 요약문 ...6
• 연구결과보고서 요약문 ...6
• Summary ...7
• II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...8
• 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...8
• 1.1 총괄연구개발과제의 목표 ...8
• 1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도 ...15
• 1.3 국내.외 기술개발 현황 ...15
• 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ...20
• 2.1 연구내용 ...20
• 2.2 연구방법 ...28
• 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...31
• 3.1. NF-kB 에 의해서 조절되는 형질전환 세포주의 개발 ...31
• 3.2. 형질전환 세포주를 이용한 단클론항체 의약품의 효력평가(In vitro 전임상 약리평가) ...37
• 3.3. 표적 특이적인 단클론항체의약품의 안전성 약리 및 약동학 모델 개발연구( In vivo 전임상 약리평가) ...38
• 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...45
• 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과 ...47
• 5.1 활용성과 ...47
• 5.2 활용계획 ...48
• 제6장 기타 중요변경사항 ...49
• 제7장 참고문헌 ...49
• 제8장 첨부서류 ...51