보고서 정보
주관연구기관 |
바이오톡스텍(주) |
연구책임자 |
이혜영
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2009-11 |
과제시작연도 |
2009 |
주관부처 |
식품의약품안전청 |
사업 관리 기관 |
식품의약품안전청 Korea Food & Drug Administration |
등록번호 |
TRKO201000015196 |
과제고유번호 |
1475005105 |
DB 구축일자 |
2013-04-18
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키워드 |
오수유.조제물분석.반복독성.유전독성.Evodia officinalis.Validation.repeated dose toxicity.genotoxicity.
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초록
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[1] 오수유의 조제물의 농도 분석법 Validation 및 안정성 확인시험
본 연구에서는 오수유의 조제물 분석법 검증을 위해 HPLC를 이용하여 분석법 validation을 수행하였다. 시스템 적합성, 직선성, 특이성, 일내재현성 측정결과 판정기준을 모두 만족하였으며, 조제물은 상, 중, 하층에서 모두 균질하였다. 고농도 400 mg/mL 와 저농도 10 mg/mL 농도의 조제물은 실온에서 4시간, 냉장에서 7일간 안정한 것으로 확인되었으며, 측정을 위해 처리된 시료는 autosampler 내에서 저농도는 14 시간 동안 안
[1] 오수유의 조제물의 농도 분석법 Validation 및 안정성 확인시험
본 연구에서는 오수유의 조제물 분석법 검증을 위해 HPLC를 이용하여 분석법 validation을 수행하였다. 시스템 적합성, 직선성, 특이성, 일내재현성 측정결과 판정기준을 모두 만족하였으며, 조제물은 상, 중, 하층에서 모두 균질하였다. 고농도 400 mg/mL 와 저농도 10 mg/mL 농도의 조제물은 실온에서 4시간, 냉장에서 7일간 안정한 것으로 확인되었으며, 측정을 위해 처리된 시료는 autosampler 내에서 저농도는 14 시간 동안 안정하였다.
[2] 오수유의 랫드를 이용한 2주 반복 경구투여 용량결정시험
오수유의 90일 반복투여 독성시험시 용량설정 근거로 사용하고자, 6주령 (투여개시시 주령) 암.수 F344 (F344NSlc) 랫드에 125, 250, 500, 1000, 2000 mg/kg의 5개의 용량으로 14일간 총12회 강제 경구 투여하였다. 대조군에는 주사용수를 투여하였다. 일반증상 관찰, 체중측정, 부검시 장기중량 측정과 육안적 검사를 실시하였고, 주요장기에 대해 조직병리학적 검사를 수행하였다.
암.수 시험물질투여군에서 일반증상, 체중, 장기중량 및 부검에서 시험물질에 의한 영향은 관찰되지 않았다.
조직병리학적 검사 결과, 암.수 2000 mg/kg 투여군에서 시험물질에 의한 소견은 관찰되지 않았다.
이상으로 오수유를 2주 경구 반복 투여한 결과, 암.수 2000 mg/kg 투여군에서 시험물질 투여에 기인한 독성변화가 관찰되지 않았다. 따라서 13주 반복투여 독성시험의 고용량은 2000mg/kg으로 설정해야 할 것으로 판단된다.
[3] 오수유의 랫드를 이용한 13주 반복 경구투여 독성시험
수유에 대한 반복 경구투여시 발현될 수 있는 독성에 대한 안전성을 평가하고자, 암수 랫드를 이용하여 13주 반복 경구투여 독성시험을 실시하였다.
혈액생화학적 검사 결과, 수컷 222, 667 및 2000 mg/kg 투여군에서 알라닌 아미노기전이효소, 총콜레스테롤 및 트리글리세라이드의 감소, 암컷 667 및 2000 mg/kg 투여군에서 알라닌 아미노기전이효소의 감소, 암컷 222, 667 및 2000 mg/kg 투여군에서 혈당 및 총콜레스테롤의 감소가 유의성 있는 변화로 확인되었으며, 시험물질에 투여에 의한 영향으로 판단되었다. 간기능과 관련된 항목의 변화는 간세포 또는 담관계의 손상 및 간세포의 대사의 변화가 원인으로 알려져 있다. 따라서, 조직병리학적 검사결과에서 간세포 파괴나 담관의 손상과 연관성이 없었으므로 간세포의 대사가 원인인 것으로 추정되었다.
장기중량 측정 결과, 암수 2000 mg/kg 투여군에서 간의 절대중량 및 상대장기중량비가 유의성 있게 증가하였으나, 모두 10% 내외의 경미한 증가였고, 간의 형태학적 변화는 동반하지 않아 간의 대사효소의 활성증가에 기인한 변화로 판단하였다.
일반증상, 체중 및 사료섭취량, 뇨검사, 혈액학적 검사, 암컷 성주기 검사, 수컷의 정자검사, 부검 및 조직병리학적 검사에서 시험물질 투여에 기인한 독성변화는 인정되지 않았다.
이상으로 오수유에 대한 암수 랫드를 이용한 13주 반복 경구투여 독성시험을 실시한 결과, 암수 시험물질투여군에서 독성변화가 인정되지 않았다. 따라서 본 시험 조건 하에서의 무독성량(NOAEL)은 암수 모두 2000 mg/kg을 상회하는 것으로 판단된다.
[4] 오수유의 세균을 이용한 복귀돌연변이시험
시험물질인 오수유의 유전자돌연변이 유발성을 히스티딘 요구성인 살모넬라균 (TA98, TA100,TA1535, TA1537) 및 트립토판 요구성인 대장균 (WP2uvrA(pKM101))을 이용하여 대사활성화비 존재하 및 존재하인 각각의 경우에 대해 검토하였다.
용량설정시험의 결과, 대사활성화비존재하 및 존재하의 모든 균주에서 생육저해가 관찰되지 않았다. 시험물질의 침전은 대사활성화의 유무에 관계없이 이용된 모든 균주의 모든 용량에서 관찰되지 않았다.
본시험의 최고용량은 모든균주에서 대사활성화비존재하 및 존재하의 5000 μg/plate를 최고용량으로 설정하고 최고용량을 포함한 5용량 (공비 2)을 시험물질군으로 설정하였다. 또한 음성대조군 및 양성대조군을 설정하였다.
본시험의 결과, 각 균주에 있어 시험물질군의 복귀변이콜로니수는 대사활성화 비존재하 및 존재하에서 용량의존적으로 증가되지 않았으며 음성대조군과 비교하여 2배 이상의 증가를 보이지 않았다. 또한 대사활성화비존재하 및 존재하에서 모든 균주의 모든 용량에서 시험물질에 의한 생육저해 및 침전은 관찰되지 않았다.
한편, 각 균주에서 양성대조군의 복귀변이콜로니수는 음성대조군과 비교하여 확실한 증가가 인정되었다.
이상의 결과로부터, 본 시험조건에서 시험물질인 오수유의 유전자돌연변이 유발성은 음성으로 판정되었다.
[5} 오수유의 포유류 배양세포를 이용한 염색체이상
시험 시험물질인 오수유의 염색체이상 유발성 유무를 검토하기 위하여 Chinese Hamster Lung (CHL/IU) 배양세포를 이용한 염색체이상시험을 실시하였다.
세포증식억제시험의 결과, 세포독성이 관찰되지 않았다. 따라서, 5000 μg/mL 를 본시험의 최고용량으로 설정하고 이하 공비2로 최고용량을 포함한 총3용량의 시험물질군을 설정하였다. 또한 음성 대조군 및 양성대조군을 설정하였다.
시험결과 단시간처리법의 대사활성화비존재하 및 존재하, 연속처리법의 대사활성화 비존재하 모두에서 각 용량의 구조이상 및 수적이상을 가진 세포의 출현빈도는 5% 미만으로 염색체이상 유발작용은 인정받지 않았다.
한편, 양성대조군의 구조이상을 가진 세포의 출현빈도는 현저하게 증가하였다.
이상의 결과로부터 본 시험조건하에서 시험물질인 오수유는 단시간처리법의 대사 활성화비존재하 및 존재하, 연속처리법의 대사활성화비존재하 모두에서 Chinese Hamster Lung (CHL/IU) 배양세포에 대해 염색체이상을 유발하지 않는 것으로 판단된다.
[6] 오수유의 마우스를 이용한 소핵시험
시험물질인 오수유의 마우스 골수세포에 대한 소핵유발 유무를 평가하기 위하여 시험을 실시하였다.
최고용량 및 검체제작시간을 설정하기 위하여, 용량설정시험 및 골수도말표본 제작시간 설정시험을 실시하였다. 이러한 결과에 따라 본시험에서의 최고용량은 2000 mg/kg으로 투여 후 24시간을 골수세포 채취시간으로 결정하였다.
소핵시험은 시험물질 500, 1000 및 2000 mg/kg의 총 3용량을 설정하였으며 각 군당 5마리의 마우스를 사용하였다. 또한 음성대조군 및 양성대조군을 두었다.
본시험의 결과, 모든 시험물질군에서 시험물질 투여에 의한 사망동물은 없었고 독성증상도 관찰되지 않았다.
체중변화는 실험 전 기간을 통하여 유의성 있는 변화는 관찰되지 않았다.
시험물질군에서 다염성적혈구 (Polychromatic erythrocyte, PCE)중 소핵다염성적혈구(Micronucleated polychromatic erythrocyte, MNPCE)의 빈도는 모든 용량에서 음성대조군과 비 교하여 통계학적으로 유의한 증가(p<0.05)가 관찰되지 않았다. 또한 모든 시험물질군에서 총 적혈구 중 다염성적혈구의 비율은 음성대조군과 비교하여 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
한편, 양성대조군의 다염성적혈구 중 소핵다염성적혈구의 출현빈도는 음성대조군과 비교하여 현저한 증가가 인정되었다.
이상의 결과로 오수유는 본 시험의 조건하에서 마우스 골수세포의 소핵유발에 영향을 주지 않는 것으로 판단된다.
Abstract
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[1] Validation of analytical method and determination of the stability of Evodia officinalis’s formulation
This study was performed to validate the analytical method of formulations for Evodia officinalis by high performance liquid chromatograph. The results of system suitability, linearity, spec
[1] Validation of analytical method and determination of the stability of Evodia officinalis’s formulation
This study was performed to validate the analytical method of formulations for Evodia officinalis by high performance liquid chromatograph. The results of system suitability, linearity, specification, and intra-day were satisfied with a criterion. And, formulations were homogeneous each phase as upper, middle, and bottom. Formulations that were formulated by high concentration (400 mg/mL) and low concentration (10 mg/mL) were stable for 4 hours at room temperature and for 7 days under refrigeration. In autosampler, the treated samples for analysis were stable for 14 hours in low and high concentrations, respectively.
[2] 2-week oral dose range finding study of Evodia officinalis
This study was performed to determine the dose levels for performing 90 days repeated dose toxicity study in male and female F344 (F344NSlc) rats. The test substance, Evodia officinalis, was administered orally 12 times to 6-week male and female F344 rats at the doses of 125, 250, 500, 1000, and 2000 mg/kg for 2 weeks. The control group was administered the vehicle (Water for injection) alone. Each group had 5 animals per sex. Monitoring clinical signs and measuring body weight were conducted throughout the study. At the end of dosing, all animals were necropsied with major organs being weighed, and histopathological findings were examined.
There were no deaths in all animals.
No abnormal clinical signs were observed in the male and female treatment groups.
No significant difference was observed on the body weights and organ weights in the male and female treatment groups. At necropsy, no treatment-related macroscopic findings were noted in all animals.
There were no treatment-related histopathological findings in the male and female 2000 mg/kg groups.
As a result of the 14-day dose range finding study of Evodia officinalis, there were no toxicological signs in the males and females treated with 2000 mg/kg test substance.
Therefore, the high dose level for 13 weeks repeated dose toxicity study is considered to be 2000 mg/kg.
[3] 13-week repeated ora l dose toxicity study of Evodia officinalis
This study was conducted to assess the toxic reaction of the test substance, Evodia officinalis, when administered five times per week -old F344 (F344NSlc) rats by oral gavage for a periodge fo3 weeks. Test groups consisted of five dosed groups at dose levelage fr a 74a ppp, 67eks. Test groupsplus the e dosed. Observationage f clinical signs, measurementage fbody weight and foodgconsumption, ght amesis, and vagt amgcy logyumption, ght amesis, and vagt amgcy logyumption, ght amesisbloodg samples mption,llet amefor hematological and bloodgchemistryugchemiationa lo and vagt a mgcy logyumption, ght amesisblos being weighed; sperm morphology and histopathological findings were examined.
Decreases of ALT and total cholesterol were evident in males of 222, 667 and 2000 mg/kg group, decreases of ALT were evident in females of 667 and 2000 mg/kg group, and decreases of glucose and total cholesterol were evident in females of 222, 667 and 2000 mg/kg group. There were no histopathological alterations related to destruction of liver cells and damage of bile ducts. Therefore, these were considered to be related with metabolism in liver functions against test substance.
Increased absolute and relative organ weights of the liver were evident in the 2000 mg/kg group. The changes were considered to be related with activity increases of metabolic enzyme in the liver due to without histopathological correlation.
No statistically significant differences in the examinations of clinical signs, body weights, food consumption, urinalysis, hematology, blood chemistry, vaginal cytology, sperm morphology and organ weights were noted in males and females dosed with the test substance.
Based on these results, the no observed adverse effect level (NOAEL) of Evodia officinalis in 13-week oral repeated dose toxicity study to male and female rats was considered to be greater than 2000 mg/kg.
[4] Bacterial reverse mutation test of Evodia officinalis
This study was designed to examine the mutagenic potential of Evodia officinalis using Salmonella typhimurium (TA98, TA100, TA1535, and TA1537) and Escherichiacoli (WP2uvrA(pKM101)) strains.
As a result of preliminary dose range-finding test, the growth inhibition and deposition were not observed at all dose levels in the absence and presence of metabolic activation systems.
According to the result of dose range-finding test, the highest dose in main test was determined as 5000 μg/plate and was sequentially diluted by a geometric ratio of 2 to produce additional 5 lower dose levels (2500, 1250, 625, 313, and 156 μg/plate). And the negative and positive control groups were set.
As a result of main test, the number of revertant colonies in all strains was not increased more than twice as compared with that of the negative control group in the absence and presence of metabolic activation. The growth inhibition and deposition were not observed in all strains in the absence and presence of metabolic activation.
In the positive control, the number of revertant colonies was distinctly increased as compared with that of the negative control group.
In conclusion, the test substance, Evodia officinalis, showed the mutagenic potential under the conditions of this study.
[5] In vitro chromosome aberration test of Evodia officinalis using mammalian cultured cell
This study was conducted to examine the potential of the test substance, Evodia officinalis, to induce chromosome aberrations in Chinese hamster lung cell (CHL/IU).
As a result of a growth inhibition test, cytotoxicity was not observed for the short time treatment both without and with metabolic activations and in the continuous treatment.
Therefore, the highest dose for in vitro chromosome aberration test was determined as 5000 μg/mL for the short time treatment both without and with metabolic activations and in the continuous treatment. Those were sequentially diluted by the geometric ratio of 2 to produce 3 additional lower doses accompanied by the negative and positive control groups.
As a result, the frequency of the structural chromosome aberration and the number of structural chromosome aberration cells chromosome aberration cells was less than 5% in the short time treatment both without and with metabolic activations and in the continuous treatment of all doses of the test substance.
In the positive control group, the structural chromosome aberration was significantly increased (Fisher’s exact test, p<0.05).
The test substance, Evodia officinalis, did not show the chromosome aberrations in the short time treatment without and with metabolic activation and the continuous treatment using Chinese hamster lung cell (CHL/IU) under the conditions of this study.
[6] In vivo micronucleus test of Evodia officinalis in mice
This study was performed to determine the mutagenic potential of the test substance, Evodia officinalis, in the micronucleus test using bone marrow cells when administered once by the oral gavage to male ICR mice.
For the determining of the highest dose and bone marrow collection time, the dose range finding test and bone marrow collection time determining test were performed. As a result, the highest dose for invivo micro nucleus test was determined as 2000 mg/kg and the bone marrows were collected at 24 hours after the administration.
In vivo micronucleus test was conducted at 3 dose levels of 500, 1000 and 2000 mg/kg of the test substance. In addition, the negative and positive control groups were included in the test. Five mice per group were used.
As a result of main test, the animal death and clinical signs were not observed at all doses of test substance.
There was not body weight change during the test period.
There were no statistically significant increase and dose-dependency (p<0.05) in appearance ratio of micronucleated polychromatic erythrocytes (MNPCE) in polychromatic erythrocytes (PCE) for all test substance groups as compared with that of the negative control group. The proportions of PCE in total erythrocyte were also no significant difference between test substance group and negative control group.
In the positive control, the appearance ratio of MNPCE in PCE was significantly increased as compared with that of the negative control group.
Based on these results, it was concluded that the test substance, Evodia officinalis, did not influence ooooooooooooooooooooformation in the bone marrow cells of mice under the condition of this study.
목차 Contents
- 표지 ...1
- 용역연구개발과제 최종보고서 ...2
- 제출문 ...3
- 목차 ...4
- I. 연구개발결과 요약문 ...5
- 1. 한글요약문 ...5
- 2. 영문요약문 ...10
- II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...15
- 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...15
- 1절. 총괄연구개발과제의 목표 ...15
- 2절. 총괄연구개발과제의 목표달성도 ...16
- 3절. 국내.외 기술개발 현황 ...17
- 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ...18
- 1절. 연구내용 ...18
- 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...58
- 1절. 오수유의 조제물의 농도 분석법 Validation 및 안정성 확인시험 ...58
- 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...243
- 제5장 총괄연구개발결과의 연구성과 ...245
- 제6장 기타중요변경사항 ...246
- 제7장 참고문헌 ...246
- 제8장 첨부서류 ...247
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